Estado fisiológico y detección de virus en semilla de papa almacenada en Pico El Aguila, Mérida, Venezuela*

Yorman Rodríguez** Gustavo Trujillo*** Eduardo Ortega C.****

ABSTRACT

COMPENDIO

La presencia de virus se evaluó en lotes de semilla de papa almacenadas en la localidad de Pico El Aguila (4118 msnm) estado Mérida. En 1992, en el almacén seleccionado existían 2549 sacos y 5272 huacales (50 kg) de papa tipo pasilla, de los cultivares Granola, Sebago, Andinita, ICA Guantiva y Kennebec, distribuidos en 83 lotes. De cada lote se tomó una muestra al azar de 30 tubérculos que fueron plantados al uniformizarse la brotación. Utilizando la técnica serológica ELISA, se detectó la presencia de PVX en ocho muestras, de PVS en tres muestras y, en mayor frecuencia, de infección doble PVX + PVS en 19 muestras, lo que indica un total de 36% de infección en la semilla. PVY y PLRV no se detectaron en ninguna de las muestras. Durante 1994, existían en el mismo almacén más de 5000 huacales pertenecientes a seis productores semilleristas, de los cultivares Granola y Andinita, encontrándose mayor proporción de Granola, clase Certificada seguida de Registrada, Básica y tipo pasilla. De Andinita, existían la clase Certificada y el tipo pasilla. Se colectaron 174 muestras en total, cada una de 16 tubérculos, con un peso promedio de 2 kg/muestra, utilizando el método de muestreo de proporciones en lotes almacenados de papas recomendado por el Centro Internacional de la papa (CIP). La prueba serológica indicó la presencia de PVY en una muestra y el PLRV en cuatro muestras de la variedad Granola, clase Certificada. También se detectó el PLRV en 4 muestras de la variedad Andinita, en el tipo pasilla. Palabras clave: almacenamiento, virus, Elisa, clase de semilla.

INTRODUCCION

El almacenamiento de papa, tanto para consumo como semilla, debe ser una parte integral del sistema total de producción y se hace necesario para abastecer los requerimientos de siembra en el próximo ciclo del cultivo (Booth et al.,1986).

El tubérculo-semilla juega un papel primordial dentro del proceso de producción, y por ser una unidad biológica de fácil deterioro, su manejo, desde la cosecha hasta el almacenamiento, debe ser muy cuidadoso, evitando el daño mecánico, el cual además de causar el debilitamiento fisiológico facilita el ataque de plagas y enfermedades (Alcalá et al., 1990). En el país existen las instalaciones de Pico El Aguila, estado Mérida ubicada a una altitud de 4118 msnm con temperatura promedio de 11.5°C y humedad relativa de 68%. El conjunto de almacenes, pertenecientes a la Corporación de Mercadeo Agrícola (CMA), está conformado por 16 galpones destinados exclusivamente al almacenamiento de papa (Banco Agrícola y Pecuario, 1969; Perozo y Echeverría, 1986). Fueron construídos aprovechando la temperatura ambiente, lo cual abarata los costos de almacenamiento por cuanto se prescinde de la refrigeración mecánica, además de tomarse en consideración que la zona Andina es una de las principales productoras de papa (Banco Agrícola y Pecuario, 1969; Ortega, 1988).

Los tubérculos-semillas   almacenados en estas unidades son procedentes  de siembras para consumo,  seleccionados  por los  productores  de los estados Mérida,  Lara y  Yaracuy. Además  se almacena semilla básica y certificada nacional de  los mismos estados e importada de Canadá  y  Alemania, así como también papa-semilla de los estados Aragua,  Lara y  Yaracuy  de la clase certificada importada  y  de  tipo pasilla (tubérculos procedentes de siembras comerciales no sujetas a certificación) (Ortega, 1988).

Debido a que no se conoce la sanidad del material almacenado en relación a los virus, y presencia de pudriciones secas y de enfermedades latentes causadas por bacterias y en vista de la importancia que tienen éstos en la producción de papa, se consideró de interés evaluar la presencia de los mismos en este tipo de material.

Los objetivos de esta investigación fueron: detectar la presencia de los virus PVX, PVS, PVY y PLRV por la técnica serológica de ELISA en tubérculos-semillas y evaluar las condiciones fisiológicas de los tubérculos-semillas, así como la presencia de otros microorganismos patogénicos.

MATERIALES Y METODOS

Primera etapa: se realizó en 1992 en los galpones de almacenamiento de papa en el Pico El Aguila. Para ello se tomó en consideración la cantidad de tubérculos-semillas almacenados para la época por los productores y la distribución de los sacos y huacales en dichas unidades. De acuerdo a estas consideraciones, el muestreo se realizó en el galpón "B" del sector privado.

De cada lote se extrajo al azar un saco y/o huacal, tomándose 30 tubérculos aleatoriamente, una vez vaciado el material en el piso, con el objetivo de no tomar solamente tubérculos de la parte superior. Estos tubérculos fueron colocados en bolsas de papel. A cada muestra se le tomó los datos descritos en la ficha de registro de cada productor; además se evaluaron otras variables como fueron: tamaño de los grelos, ahilamiento de los grelos, deshidratación de los tubérculos, tiempo de almacenamiento y presencia de pudriciones húmedas y secas. Las muestras de tubérculos con pudriciones fueron analizadas en laboratorio para identificar el agente causal.

Las muestras de tubérculos-semillas fueron almacenadas hasta el inicio de la brotación de los cultivares que aún se encontraban en período de reposo y así uniformizar la siembra de todo el material muestreado. Luego se procedió a la siembra de los tubérculos en bolsas de polietileno de 3 kg de capacidad en los umbráculos del Campo Experimental del FONAIAP. Se utilizó una mezcla estéril de pulpa de café, tierra negra y fibra de coco en la proporción 1:1:1/2, por resultar la mejor combinación en investigaciones previas realizadas (Rodríguez y Pire, 1988). Desde el inicio de la brotación de las plantas se realizaron aplicaciones de Pirimicarb en dosis de 2 g/l para prevenir ataque de áfidos. Cuando las plantas tenían 20 días de emergidas, se tomaron folíolos de hojas de la parte superior, media e inferior de la planta, formando así una muestra compuesta de los 30 tubérculos. Las muestras se tomaron utilizando bolsas plásticas. Para el diagnóstico de virus se emplearon kits de ELISA de diagnóstico comercial del Centro Internacional de la Papa (CIP). Se utilizó la modalidad del método directo de doble capa de anticuerpos, según el procedimiento descrito por Salazar (1983), y manual de instrucción para diagnóstico de ELISA del CIP (1990). Inicialmente las placas fueron cubiertas con los anticuerpos (lgG): PVX-IgG, PVY-IgG, PVS-IgG y PLRV-IgG; cada anticuerpo fue diluido en proporción 1:50 en buffer de recubrimiento (0.4 g Na2CO3, 0.73 g NaMCo3 , 0.5 g NaN3, 50cm3 de agua destilada). Se incubaron a 37ºC por 4 horas. Luego las muestras de tejido fresco, se maceraron con buffer de extracción en proporción 1:100 (p/v, respectivamente), en bolsas de plástico con cierre hermético con ayuda de un mazo de mortero. El buffer de extracción fue fosfato salino - tween 20 (pbs-tween), con albúmina de huevo al 0.2% (AH) y polivinilpirrolidona (pvp de peso molecular 40000) al 4%. El buffer conjugado se preparó con pvp-40000, AH, pbs-tween y los conjugados PVX, PVY, PVS y PLRV. El buffer del sustrato para cada placa consistió en mezclar 2.5 cm3 del tampón del sustrato (29.1 ml de diethanolamina, 16.9 ml de agua destilada y 4.0 ml de ácido clorhidrico (37%)), con 12.5 cm3 de agua destilada, en la cual se disolvieron dos tabletas de sustrato.

En las placas con los anticuerpos, se colocaron 100 m l de jugo vegetal por celda, de manera duplicada, dejando en cada placa dos celdas para cada uno de los controles positivos y negativos (plantas de la variedad Kennebec in vitro). Se incubaron en una refrigeradora doméstica durante toda la noche, se lavaron con pbs + tween por tres veces, remojando por 3 minutos. Se colocaron por separado 100 m l de cada conjugado (PVX, PVS, PVY y PLRV) y se incubó a 37ºC por 4 horas. Se lavó nuevamente con pbs-tween. En cada celda se colocaron 100 (m l de sustrato y se dejaron las placas a temperatura ambiente entre 30 a 60 min para que ocurriera la reacción.

Segunda etapa: se realizó durante 1993-1994. En esta ocasión por el problema existente del encarecimiento de la semilla de papa importada, un grupo de productores se organizaron en una asociación y usando el mismo galpón "B" muestreado en 1992, donde se almacenaba solamente papa-pasilla, para este período se inicia el almacenamiento de semilla certificada y registrada, tanto de papa nacional como importada. Estos productores semilleristas están bajo la supervisión y fiscalización del Fondo Nacional de Investigaciones Agropecuarias (FONAIAP). Al momento del muestreo existían en el almacén más de 5000 huacales, pertenecientes a seis productores. Se utilizó el método de "muestreo de proporciones en lotes almacenados de papas" recomendado por el CIP (1990). De ello se obtuvieron 174 muestras y cada una se formó de 16 tubérculos con un peso promedio de 2 kg/muestra. Los tubérculos se tomaron aleatoriamente, una vez vaciado el material, con el objetivo de no tomar solamente tubérculos de la parte superior. Los tubérculos-semillas fueron almacenados adecuadamente para uniformizar la brotación. La serología a nivel de brote se hizo por la técnica de ELISA, utilizando el método directo en la modalidad de doble capa de anticuerpos. Los kit de ELISA fueron suministrados por el Centro Internacional de la Papa.

RESULTADOS Y DISCUSION

Primera etapa: los cultivares almacenados para el momento del muestreo de mayor a menor cantidad de sacos y/o huacales de semilla tipo pasilla fueron Granola, seguido de Sebago, Andinita, Ica Guantiva y por último Kennebec. El material almacenado procedía de la zona Andina (estados Mérida y Trujillo), y de los estados Aragua y Carabobo (Cuadro 1).

Cuadro 1. Cultivares, número de sacos y huacales de semilla de papa almacenada en el galpón "B", del Pico El Aguila, estado Mérida, Venezuela. 1992

En el análisis serológico se determinó la infección simple con los virus PVX, PVS, y la infección doble PVX + PVS. Esta última se detectó con mayor frecuencia en 19 muestras, seguida de ocho para el PVX y con tres para el PVS. El PVY y el PLRV no se detectaron en ninguna de las muestras. En las 83 muestras analizadas se detectaron 30 con virus y 53 resultaron sanas; lo cual nos indica un 36% de infección en la semilla (Cuadro 2). La prevalencia de los virus transmitidos mecánicamente (PVX, PVS), en semillas certificadas y el tipo pasilla fue señalada en investigaciones anteriores (Ortega y Leopardi, 1989; Rodríguez et al., 1994).

Cuadro 2. Muestras infectadas con virus y sanas en semilla de papa almacenada en el galpón "B" de Pico El Aguila, estado Mérida. Venezuela. 1992

Niveles de infección altos en papa-pasilla fueron informados con anterioridad para PVX (Achutegui, 1982) y PVY (Escobar, 1982) y para PLRV (Debrot, 1975) en zonas de los estados Aragua y Carabobo especialmente de este último. Estos resultados indican que se debe alertar al productor del peligro potencial que corren al seguir multiplicando esta semilla con estos virus por varias generaciones, debido a que se diseminan muy fácilmente. Además que el encarecimiento progresivo de la semilla, los ha llevado a la multiplicación por el sistema informal (material no sujeto a certificación) (Ortega, 1990).

En la evaluación del material almacenado se constató que el cultivar Sebago, procedente de Villa de Cura, estado Aragua con tres meses de almacenamiento, presentó deshidratación, bacteriosis causada por Erwinia sp y pudrición seca causada por Fusarium sp. Este mismo cultivar procedente de La Mucumpate, estado Mérida y con dos meses de almacenamiento presentó deshidratación y pudrición causada por Pseudomonas solanacearum y Erwinia sp. En otro lote de Sebago procedente de Bejuma, estado Carabobo con nueve meses de almacenamiento, se determinó un estado muy avanzado de deshidratación, grelos bastantes largos y ahilados. Además se determinó la presencia de Fusarium sp.

Un cultivar que se observó con deshidratación y pudriciones causadas por Fusarium sp. fue Kennebec procedente de Chirgua, estado Carabobo con dos meses de almacenamiento. Un lote del cultivar Granola, procedente de Santo Domingo, estado Mérida con seis meses de almacenamiento se observó muy grelada; los grelos se observaron ahilados y muy deshidratados. También el cultivar Ica Guantiva procedente de Santo Domingo, estado Mérida con ocho meses de almacenamiento se encontró muy grelado y deshidratado (Cuadro 3).

Cuadro 3. Estado fisiológico de tubérculos - semillas almacenadas en Pico El Aguila, estado Mérida. Venezuela.

De los 83 lotes de semilla muestreados, solamente seis presentaron los problemas antes descritos y tomando en consideración que el material tenía de dos a doce meses de almacenamiento, se puede inferir que los productores pueden mejorar el manejo de la semilla-pasilla sometiéndola a un plan de desinfección antes del período de almacenamiento y así garantizar menos pérdidas a nivel de campo, lo cual sumado a las condiciones de almacenamiento de Pico El Aguila como lo son la temperatura ambiente, humedad relativa y condiciones de luz, factores indispensables para un buen almacenamiento, lo cual minimiza las pérdidas por respiración, evaporación, brotación y patológicas (Alvarado, 1988; Booth, Shaw y Harmsworths, 1986; Burton, 1978; Shaw y Booth, 1986; Severian, Deveninck y Van Der Zaag, 1986).

Segunda etapa: Durante este período de almacenamiento, el mayor número de huacales/sacos correspondieron a los cultivares Granola y Andinita de la clase Certificada y en menor cantidad de las clases Básica, Registrada y el tipo pasilla.

Las pruebas serológicas indicaron la presencia de PVY y del PLRV en una y seis muestras respectivamente de la clase Certificada Granola; en esta oportunidad no se detectaron PVX y PVS en forma individual y en infecciones doble, diferenciándose de los resultados de la primera etapa en la que prevaleció esta última.

En relación al cultivar Andinita, no se detectaron PVX, PVY y PVS en cualquiera de las modalidades para la clase Certificada y el tipo pasilla. La infección simple de PLRV se determinó en cuatro de las seis muestras evaluadas en el tipo pasilla (Cuadro 4).

Cuadro 4. Muestras infectadas y sanas en semilla de papa almacenada en Pico El Aguila, estado Mérida. Venezuela. 1994

Los resultados de las dos etapas indican que existe una distribución muy irregular de los virus en estudio, especialmente de aquellos transmitidos naturalmente por contacto y que su diseminación dependería de la fuente de inóculo y de la raza del virus tomando en consideración la característica de reacciones latentes de los mismos (Bagnall, 1980; Beemster y Bokx, 1987). Es importante recalcar que se han señalado trabajos previos en el país (Ortega y Leopardi, 1989; Rodríguez et al., 1994) de la frecuencia de la infección doble de PVX + PVS y ello significa un peligro potencial dados los niveles de reducción de rendimiento en algunos cultivares de papa (Mauzer et al., 1979), recomendándose el estudio correspondiente de las variedades evaluadas en las diferentes áreas agroecológicas, en relación a la incidencia y pérdidas de rendimiento por efecto de la acción combinada de estos virus. La no presencia de PVY y PLRV en la clase Certificada de la variedad Granola, indican el cumplimiento de las normas de tolerancia del Servicio Nacional de Semillas (SENASEM); sin embargo, se deben realizar chequeos periódicos en la semilla almacenada en dichos almacenes y garantizar la sanidad de la semilla antes de la siembra.

La ausencia de estos virus en el tipo pasilla permite inferir la reducción de los costos de producción, por la utilización de varias multiplicaciones del material de siembra por la vía del sistema informal. Considerando la característica de resistencia relativa del cultivar Granola al PLRV (Zumbado, 1987), y que la misma se pierde con la presencia del PVX, es necesario evaluar nuevos cultivares con esta característica de resistencia.

Los resultados de infección para PLRV en la segunda etapa en el tipo pasilla del cultivar Andinita, señalan la necesidad de tomar acciones de manejo integral para no diseminar este virus por la propagación de material mediante el sistema informal, dada la característica de susceptibilidad de esta variedad (Centro Internacional de la Papa, 1990).

De los 174 lotes de semillas muestreadas, solamente seis presentaron problemas de deshidratación y en ninguno se observó problemas causados por pudriciones secas y húmedas.

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