Rev. Fac. Agron. (Maracay) 17:397-408. 1991.

Dinámica del fósforo y aislamiento de algunos microorganismos en la mezcla pulpa de café-roca fosfórica

Isbelia Reyes de Alvarez¹

ABSTRACT

Key words: soil microorganisms, phosphate rock, coffe pulp, Aspergillus, Bacillus, Enterobacteriaceae.

COMPENDIO

Se preparó un fosfocompost a base de pulpa de café y de roca fosfórica (Monte Fresco) en una relación 1:1. Se determinó P total, P extraible en HCl 0.025 N, P lábil y P moderadamente lábil. La microflora se aisló en un medio mineral a 10% de roca fosfórica. Entre la sexta y octava semana de maduración se determinó un equivalente de 12 y 11 % de P total en la fracción de P moderadamente lábil. Se aislaron algunos hongos y bacterias que se desarrollaron asociados a los microgránulos de roca fosfórica, entre los cuales se identificaron un Aspergillus, un Mucor, dos Fusarium, dos Bacillus y una Enterobacteriaceae.

Palabras clave: microorganismos del suelo, roca fosfórica, pulpa de café, Aspergillus, Bacillus, Enterobacteriaceae.

INTRODUCCION

Los factores que afectan la concentración de fósforo en la solución del suelo regulan el crecimiento de las plantas y en este sentido, el conocimiento y uso de los procesos de movilización del fósforo a partir de la actividad microbiológica en el ecosistema suelo-planta, son de gran importancia en el campo agrícola.

En Venezuela poco se conoce en relación a la acción solubilizadora de los microorganismos sobre los fosfatos naturales. Actualmente el uso de "fosfohongos", tales como cepas de Aspergillus sp. y Penicillium sp., están siendo utilizadas para incrementar la solubilidad de la roca fosfatada y del fósforo fijado en el suelo (Beever y Burns, 1980; Kucey, 1983; Asea et al., 1988). Una práctica común por los rusos desde la década de los 50 fue la inoculación de "fosfobacterinas", particularmente cepas de Bacillus megaterium var. fosfaticum (Mulder et al. 1967) en suelos con bajo contenido en fósforo disponible. La importancia de la actividad de los microorganismos en el ciclo del fósforo se manifiesta por el alto contenido de este elemento en el tejido microbiano (el micelio de los hongos contiene entre 0.5 y 1.0% y las bacterias entre 1.5 y 2.5% de fósforo por peso seco) en contraste con el contenido relativamente pequeño en cultivares (entre 0.1 y 0.5% de fósforo por peso seco) (Kaila, 1949; Mulder et al., 1966). En una revisión de literatura Beever y Burns (1980) señalan para Aspergillus niger una acumulación de fósforo en las estructuras vegetativas de 1.65% por peso seco y en algunos Zygomicetos altos contenidos como en el caso de Mucor racemosus, el cual acumula en sus extructuras vegetativas 6.3 % y Rhizopus nigricans entre 1.43 y 3.34 % de fósforo por peso seco. Trabajos recientes han estudiado la solubilización de la roca fosfórica por medio de la mineralización de la materia orgánica al preparar fosfocomposts (Mathur et al., 1980; Mathur et al., 1987; Singh, 1983, 1985; Mathur et al., 1986). La inoculación de microorganismos tales como cepas de Aspergillus, Paecilomyces, Penicillium y Azotobacter en los fosfocomposts han acortado el tiempo de maduración del mismo hasta en cuatro semanas con un aumento de la calidad y contenido de fósforo y nitrógeno (Mathur et al., 1986).

Este trabajo se inicia como un estudio preliminar a fin de conocer la dinámica del fósforo en la mezcla materia orgánica- roca fosfórica y de estandarizar métodos de aislamiento de microorganismos que puedan solubilizar la roca fosfatada. Se utilizó pulpa de café fresca y la roca fosfórica de Monte Fresco estrato II. Durante tres meses se muestreó el fosfocompost preparado determinándose el fósforo en varias soluciones y aislándose algunos microorganismos.

MATERIALES Y METODOS

I. Elaboración del fosfocompost

Se utilizó pulpa de café fresca de 15 días, con 85% de humedad proveniente de una mezcla de variedades de café de la región de Santa Ana del Táchira. La roca fosfórica de Monte Fresco, estrato II, se utilizó en la granulometría comercial. Ambos materiales se mezclaron en una relación en base al peso seco de pulpa de café-roca fosfórica, 1:1. Antes de mezclar ambos componentes se determinó el contenido de P total en cada uno de ellos. No se agregó ningún otro tipo de fertilizante. Quincenalmente se tomó una muestra compuesta la cual se dejó secar a temperatura ambiente y luego se molió en un molino marca Wiley, mod. 3375-E10, malla 20. Se realizaron mediciones de P total (digestión nítrico-perclórica), P extraíble en NaHCO₃ (según Olsen et al. 1954), P extraíble en HCl 0.025N (Bray I), P orgánico lábil y moderadamente lábil, según el fraccionamiento de P orgánico de Bowman y Cole (1978).

II. Aislamiento de la microflora solubilizadora de roca fosfatada

Se siguió la metodología (modificada) de vaciado en placa utilizada por Tardieux- Roche (1966). El medio de cultivo se preparó como sigue: MO₄.7H₂O 0.25 g; NaCl 0.5 g; NH₄Fe(SO₄)2.12H₂O 0.0121 g; MnSO₄.H₂O 0.005 g; NH₄NO₃ 1.0 g; extracto de tierra 50 ml; agua destilada 950 ml, agar 12 g; glucosa 0.5 g. Se pesó 1 g de fosfocompost seco y se mezcló con 9 ml de agua fisiológica (NaCl 0.85%), agitándose durante media hora. La suspensión diluida de la muestra se preparó por triplicado a diluciones de 1/100 y 1/1000, de las cuales se tomó 1 ml incorporándolo a una caja de petri. Inmediatamente se agregó a cada plato 0.5 ml de una suspensión de roca fosfórica al 10% (1.3 % P), habiendo esterilizado la roca previamente en seco. El todo se agitó ligeramente en forma rotativa antes de la solidificación del medio a fin de evitar la sedimentación de las partículas de roca fosfórica. Se incubó a 28 °C y las observaciones se comenzaron a realizar a partir de la primera hasta la tercera semana. La habilidad para solubilizar la roca fosfatada se determinó por la proliferación del micelio del hongo o de la colonia alrededor del gránulo de la misma.

RESULTADOS Y DISCUSION

Dinámica del fósforo en el fosfocompost.

De acuerdo a los resultados presentados en el Cuadro 1 el contenido de fósforo total, en la pulpa de café es despreciable en relación al fósforo total de la roca fosfórica, 0.15 y 13.10%, respectivamente. El fósforo total en el fosfocompost se incrementó en el tiempo, en función del peso seco, debido a la pérdida de peso relativa causada por la descomposición de la materia orgánica. El fósforo soluble en las soluciones extractoras de Olsen y Bray I en el fosfocompost, además de bajo no presentó ninguna tendencia; mientras que el fósforo soluble en H₂SO₄ 1M varió entre 36 y 46% en relación al fósforo total de la tercera y octava semana, sin embargo, no se observó una tendencia marcada sino más bien, un comportamiento irregular hasta la semana décimo-sexta. Mishra et al. (1982) al preparar un fosfocompost de 3 kg de roca fosfatada (Mussoorie, 8.4% P) con 10 kg de diversos materiales orgánicos obtienen valores igualmente bajos de P soluble en NaHCO₃, 0.63 mg g^-1 en el fosfocompost, 1.20 mg g^-1 en el compost control y 0.18 mg g^-1 en la roca fosfórica, mientras que los valores importantes fueron extraibles en citrato y H₂SO₄.

Cuadro 1. Dinámica del P y del pH del fosfocompost en función del tiempo.

Muestra	% PT	% P NaHCO3	%Porg lábil	% P H2SO4	%P mlábil	% P HCl	pH
Fosfocompost (semanas)
2	6.32	0.059	0.011	2.33	0.000	0.014	8.30
3	6.18	0.053	0.003	2.21	0.030	0.010	8.41
5	6.67	0.059	0.006	2.94	n.d.	0.014	8.32
6	7.34	0.054	0.001	3.02	0.850	0.015	7.94
8	7.40	0.053	n.d.	3.39	0.830	0.013	7.86
10	7.60	0.062	0.003	3.11	n.d.	0.011	7.44
16	8.22	n.d.	n.d.	3.49	n.d.	0.010	7.09
Compost (semanas)
1	0.15	0.028	0.008	0.000	0.076	0.002	7.59
10	0.27	0.055	0.044	0.000	0.199	n.d.	6.72
Roca fosfórica	13.10	n.d.	n.d.	7.81	n.d.	0.003	5.60

n.d.: no determinado; mlábil: moderadamente lábil.

El contenido de roca fosfórica en el fosfocompost según la relación 1:1.2 fue de 54.54%, teniendo la roca 7.81% de P soluble en H₂SO₄ 1M, se debe tener en el fosfocompost inicial alrededor de 4.26% de P soluble en esta solución. La diferencia posiblemente ha sido incorporada al metabolismo microbiano y debería encontrarse asociada a las fracciones de P-fúlvico y de P-húmico. Al determinarse el fósforo moderadamente lábil se encontró en la sexta y octava semana, 0.85 y 0.83 %, lo cual es equivalente a un 12 y 11% del fósforo total, respectivamente. Esta última fracción consiste en P orgánico soluble en ácido y P inorgánico soluble en álcali (Bowman y Cole, 1978).

El pH de las muestras disminuyó desde 8.30 en la segunda hasta 7.09 en la semana décimo-sexta. El incremento de la acidez se concentró entre las semanas quinta y décima (Cuadro 1), encontrándose que éste se correlaciona significativamente (r=0.9564 p << 0.01) con el incremento de la concentración del fósforo total en el fosfocompost. La mineralización de la materia orgánica y los procesos metabólicos de los microorganismos que actúan en ella producen la liberación de ácidos de origen inorgánico y orgánico, los cuales van a provocar la solubilización de la roca fosfatada ya sea por la acidez concentrada en los microhabitats donde se alojan los microgránulos de roca fosfatada y/o por la acción quelatante de estos ácidos (Kucey, 1988). Sinha (1975) encontró al estudiar el efecto residual de la roca fosfatada al mezclarla con pajilla de arroz y vainas de arvejas que los ácidos húmicos y principalmente los fúlvicos presentaban una acumulación importante. Igualmente Chauhan et al. (1979), al agregar carbono orgánico en la forma de heno seco y celulosa en un suelo negro chernozémico, en un experimento de incubación utilizando el método de fraccionamiento de fósforo usado en este trabajo, hallaron que la fracción más importante fue la del P-fúlvico o fósforo moderadamente resistente. En el presente trabajo se determinó solamente el fósforo lábil y moderadamente lábil, pero no se lograron determinar las fracciones de P-fúlvico y P-húmico (altamente resistente).

Aislamiento de algunos microorganismos que estarían actuando en la solubilización de la roca fosfatada

Después del segundo día de incubación del medio de cultivo con roca fosfatada como fuente de fósforo, se comenzó a observar la emergencia de hongos en el agar y en su superficie. En los primeros días hubo un gran desarrollo de micelio proveniente de diferentes hongos, pero al final de la primera semana sólo algunos se extendían sobre la superficie del agar y dentro del mismo hasta alcanzar con el micelio los gránulos de roca adyacentes o localizados hacia la profundidad de la placa. Uno de los hongos que proliferó en número y fue aislado del agar propiamente se observa en las Figuras 1 y 2, mostrando el crecimiento del micelio asociado a los gránulos de roca fosfatada. Otros hongos aislados fueron un Aspegillus sp. que proliferó en la superficie de las placas de Petri, un Mucoral y dos del género Fusarium, uno de esporas terminales y otro de esporas laterales. Estos tres últimos también fueron aislados de la superficie de la placa.

Figura 1.Detalle del hongo no identificado con el micelio desarrollándose cerca de los gránulos de roca fosfatada, (20X).

Figura 2.Micelio bifurcado alrededor de un gránulo de roca fosfórica.

La inoculación de hongos en el fosfocompost ha permitido un aumento en la formación de humus, como en el caso de la inoculación de Aspegillus niger el cual incrementó significativamente la disponibilidad de P₂O₅ al final de la décima tercera semana respecto al control sin roca fosfórica (Mathur et al., 1986). Ortuño et al. (1979a, 1979b ), encontraron en un ensayo de incubación al utilizar fosfato tricálcio como fuente de fósforo insoluble, que A. niger comenzó a solubilizar a las 24 horas, llegando a un máximo a los 7 días, también cuantificaron que la fijación biológica de este elemento en los procesos metabólicos es menor que su mineralización al estado de fosfato asimilable. Otros hongos utilizados en la investigación de la disolución de los fosfatos han sido Aspegillus awamori en un fosfocompost (Mishra, 1982) y Penicillium bilaji en la solubilización de la roca fosfatada en cultivos líquidos, y en experimentos de invernadero con un incremento del 16% de la materia seca y un 14% de la absorción de fósforo por el trigo (Asea et al., 1988). Este mismo hongo ha sido estudiado en cuanto a la movilización de las formas insolubles de Cu, Fe y Zn y del fósforo fijado en el suelo (Kucey, 1988 y Asea et al., 1988).

Las colonias bacterianas que comenzaron a aparecer a los 7 días, eran de pequeño diámetro (0.5-1.0 mm), algunas esparcidas en el agar y otras asociadas a los gránulos de roca fosfatada. Se aislaron seis cepas bacterianas, tres Gram positivas y tres Gram negativas, algunas pruebas bioquímicas se presentan en el Cuadro 2. Las cepas 1 y 6 son del género Bacillus y la cepa 3 corresponde a la familia Enterobacteriaceae, caracterizada por un metabolismo respiratorio y fermentativo con la producción de ácido a partir de la glucosa. Las cepas 1 y 6 también son productoras de ácido a partir de la glucosa. Estas cepas pueden ser importantes en la solubilización de los fosfatos mediante la liberación de ácidos provenientes del metabolismo microbiano. La cepa 1 se presenta en la Figura 3 en la cual podemos observar un gránulo de roca colonizado completamente por este Bacillus sp. La cepa 2 puede verse como una colonia transparente cuyo crecimiento ocasionó la dispersión de los gránulos de roca a su alrededor (Figura 4). Tardieux-Roche (1966) señala que la presencia de colonias sin la modificación aparente de los fosfatos, muestra una asimilación discreta que no se acompaña necesariamente de la formación del halo, así mismo señala que una modificación del aspecto de los cristales de la apatita cerca de las colonias bacterianas no se relaciona solamente con la producción de ácidos, sino que puede ser el resultado de bacterias alcalinizantes. Las cepas 4 y 5 se aislaron del medio sin que señalaran otra relación con los gránulos de roca que su crecimiento en este medio con roca fosfórica como única fuente de fósforo.

Figura 3.Gránulo de roca fosfórica colonizado completamente por bacterias del género Bacillus, (10X).

Figura 4. Colonia bacteriana transparente, Gram positiva dispersando los gránulos de roca fosfórica, (20X).

Cuadro 2. Algunas características y pruebas bioquímicas realizadas sobre las bacterias aisladas del fosfocompost.

Cepas Aisladas	1	2	3	4	5	6
Colonias	R-O	L-B	L-B-M	L-B	L-B	R-O
Gram	+	+	-	-	-	+
Forma	B	B	C	B	B	B
Movilidad	+	-	+	-	-	+
Esporas	+	+	-	-	-	+
Caldo Nutritivo	+	(+)	+	(+)	+	+
Agar Nutritivo	+	(+)	+	(+)	+	+
Gelatina	+	+	-	-	+	+
Mac Conkey	+	-	+	-	+	-
Kliger	a	-	a g-1	-	-	-
Manitol Salado	+	-	-	-	-	+
Hidrólisis Almidon	-	-	-	n.d.	n.d.	-
Glucosa	+	+	+	(+)	(+)	+
Gaz Glucosa	-	-	+	n.d.	n.d.	-
Acidéz Glucosa	+	(+)	+	n.d.	n.d.	+
Lactosa	-	-	-	(+)	-	-
Sacarosa	-	-	+	-	(+)	+
Manitol	-	-	+	-	-	+
Gaz Manitol	-	n.d.	n.d.	n.d.	n.d.	-
Acidéz Manitol	-	n.d.	n.d.	n.d.	n.d.	(+)
Acido Sulfídrico	+	-	-	-	-	-
Nitritos	+	(+)	+	+	+	-
Urea	-	-	-	-	-	-
Indol	-	-	-	-	-	-
Rojo de metilo	+	-	-	-	-	-
Voges Proskaure	-	-	-	-	-	-
Citrato	-	-	+	+	-	+
Hemólisis Sangre	+	n.d.	n.d.	n.d.	n.d.	+
Agar Anaeróbico	+	-	+	n.d.	n.d.	+

R:rugosa; O:opaca; L:lisa; B:Brillante; M:mucoide; b:bastón; c:cocos y cocobacilos; +:prueba positiva; -:prueba negativa; (+):reacción lenta; a:amarillo; g:formación de gaz; n.d.:no se determinó la prueba.

CONCLUSIONES

1. En el fosfocompost se determinó un equivalente de 12 y 11% del fósforo total en la fracción de fósforo moderadamente lábil durante la sexta y octava semana de maduración, respectivamente.
2. El incremento de la acidez del fosfocompost se correlaciona significativamente con la concentración del fósforo total.
3. Entre los hongos se aislaron un Aspergillus, un Mucoral, dos Fusarium y un quinto hongo que no ha sido identificado aún y que parece presentar una estrecha relación con la solubilización de la roca fosfatada.
4. Se aislaron seis cepas bacterianas entre las cuales dos del género Bacillus y una Enterobacteriaceae. Estas bacterias presentaron acidificación de la glucosa, de allí su posible importancia en la solubilización de los fosfatos naturales.

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