Rev. Fac. Agron. (Maracay), 15: 235-242. 1989.

Pseudomonas syringae pv. syringae causante de la mancha marrón de la caraota (Phaseolus vulgaris L.) infectando semillas de tapiramo (Phaseolus lunatus L.)

M.J. Arcila; G. Trujillo

Financiado parcialmente por el Consejo de Desarrollo Científico y Humanístico, U.C.V., Proyecto No. 1591-87.

SUMMARY

KEY WORDS: Pseudomonas syringae, Beans, Brown spot, Phaseolus vulgaris, Phaseolus lunatus.

RESUMEN

Semillas de tapiramo (Phaseolus lunatus L.) provenientes de los estados Aragua y Carabobo fueron estudiadas para conocer la presencia de bacterias fitopatógenas. Un aislamiento bacteriano fue obtenido repetidamente e identificado mediante pruebas fisiológicas, bioquímicas y rango de huésped como Pseudomonas syringae pv. syringae causante de la mancha marrón de la caraota (Phaseolus vulgaris L.) señalada en otros países especialmente en caraota. Se señala por primera vez la existencia de esta enfermedad en Venezuela.

Palabras Clave: Pseudomonas syringae, Phaseolus vulgaris, Caraota, Mancha marrón, Phaseolus lunatus, Tapiramo.

INTRODUCCION

El tapiramo constituye, junto con otras leguminosas como la caraota y el frijol (Vigna unguiculata (L.) Walp. subsp. unguiculata), uno de los tantos granos comestibles en Venezuela; se cultiva en pequeñas extensiones y en conucos (Ganagrinco, 1974).

El rendimiento por ha de los granos leguminosos en Venezuela es bastante bajo, mientras que las necesidades de consumo y el precio son altos (MAC, 1983). Una de las causas del bajo rendimiento son las enfermedades que afectan estos cultivos; se conocen algunas enfermedades fungosas que afectan al cultivo (Ordosgoitti, Márquez y Garcés, 197l; Díaz y Salas, l980). En relación a enfermedades bacterianas la información es casi nula, sólo encontramos la cita de Tineo et al. (l987) quienes señalaron la presencia de Pseudomonas en semillas de tapiramo.

Los precios actuales de esta leguminosa son rentables y hacen atractivo su cultivo, pero es necesario conocer los problemas fitopatológicos con los que el agricultor pueda enfrentarse. Se ha realizado un estudio preliminar para conocer los posibles patógenos bacterianos presentes en la semilla de tapiramo. Un adelanto de este trabajo fué publicado (Arcila y Trujillo, l988).

MATERIALES Y METODOS

1. Obtención de semillas: en los mercados populares de Aragua y Carabobo se compraron semillas de tapiramo en los meses de agosto y octubre de 1987 y enero de 1988.
2. Preparación de las muestras: se colocaron 20 g de semillas (aproximadamente 150 semillas, desinfectadas previamente con hipoclorito de sodio al 2.5% por 3 minutos) en una fiola conteniendo 50 ml de medio nutritivo líquido (5 g de extracto de levadura en 1 l de agua destilada, esterilizada por 15 min a una presión de 20 lbs pulg-2 por 15 minutos), las fiolas se mantuvieron en contínuo movimiento en un agitador horizontal por 48 horas. Cuando las muestras, antes de iniciar este proceso, lucian deterioradas, o se sospechaba contaminación con hongos, el medio era modificado añadiendo cicloheximide hasta una concentración de 50 ppm.(El señalamiento de productos comerciales no implica recomendación de los mismos.)
3. Material para inocular: se seleccionaron semillas sanas, se desinfectaron como en (b) y se sembraron en potes con tierra estéril de 1 kg de capacidad, se mantuvieron en umbráculo protegido contra insectos hasta dos semanas, fecha en la cual fueron utilizadas para realizar las pruebas de patogenicidad. Este material se revisó periódicamente, descartándose cualquier planta sospechosa de enfermedad o que difiriese del promedio de las plantas en desarrollo.
4. Inoculación: se tomó una alícuota de la muestra preparada (b) mediante una inyectadora con aguja 21G, y se procedió a infiltrar en el tallo de las plantas a inocular sobre la marca cotiledonal, a razón de tres plantas por pote (l pote por muestra), repitiendo el proceso por lo menos tres veces. Se procesaron como mínimo tres muestras en fechas diferentes: 3 muestras x 3 repeticiones x 3 fechas, utilizando para cada fecha, por lo menos 27 plantas; 2 potes con plantas sanas se utilizaron como controles, inyectándoles agua corriente en la forma descrita. Las plantas inoculadas, se cubrieron con bolsas plásticas (efecto de cámara húmeda) por 48 horas en condiciones de umbráculo, a una temperatura promedio de 26 °C.
5. Recolección de datos: luego de retiradas las bolsas plásticas, las plantas se mantuvieron en el umbráculo por 7 - 14 días, se observaron periódicamente y se describió la sintomatología.
6. Aislamiento de los posibles patógenos: de los síntomas visibles se aislaron los posibles patógenos, tomando para ello el tejido de los márgenes de la lesión o mancha (2-3 mm), se lavó el trozo de tejido en agua destilada estéril y se maceró en un mortero estéril; luego, con un ansa de platino estéril, se realizó la siembra por agotamiento en diversos medios de cultivo comunmente usados: agar nutritivo (AN), agar levadura carbonato de calcio (YCA), agar levadura carbonato de calcio y dextrosa (YCDA), con el objeto de obtener colonias aisladas, que se replicarón para obtener cultivos puros y repetir la inoculación en plantas sanas (Postulados de Koch). Si los aislamientos bacterianos reproducían los síntomas típicos observados en el material de donde fueron aislados, y al reaislarlos, coincidían con las colonias originales, se consideraban bacterias fitopatógenas; paso este necesario para el proceso de identificación.
7. Identificación de los aislamientos: los cultivos puros de las bacterias que resultaron patogénicas fueron estudiados en la siguiente forma: a) Crecimiento en diferentes medios de cultivo, con el objeto de conocer la velocidad de crecimiento y la coloración de la colonia, así como la forma, tamaño y otras características de la colonia. Los medios de cultivo usados fueron: AN, YCA, YCDA y agar-papa-dextrosa (PDA), medio B de King, M71 de Leben, Tween 80 y Agar SX de Shaad. Todo según lo señalado por la Sociedad de Fitopatología Americana (APS, 1980).
8. Rango de hospederos: además de plantas de tapiramo, también se utilizaron plantas de frijol (Vigna unguiculata (L.) Walp. subsp. unguiculata), caraota (Phaseolus vulgaris L.), maíz (Zea mays L.) y sorgo (Sorghum bicolor (L.) Moench), las cuales fueron inoculadas como fué descrito anteriormente, con excepción de las gramíneas a las que se les realizó heridas y luego se asperjaron con el aislamiento estudiado; se utilizaron cultivos puros de 48 h de sembrados y concentraciones de bacteria entre 107 y 108 cel ml^-1.
9. Otras pruebas:  se siguió la metodología descrita por otros investigadores: APS (1980), Weller, Ritchie y White (1975); de acuerdo a lo mismo se estudió la tinción de Gram, KOH al 3%, requerimientos de oxígeno, utilización de la leche tornasolada, prueba de la catalasa, prueba de la oxidasa, hidrólisis del almidón, producción de H2S, licuefacción de la gelatina, agar dextrosa rojo fenol, proteolisis de la leche, crecimiento a diferentes temperaturas, etc.

RESULTADOS

De las muestras correspondientes a agosto de 1987 se aisló una bacteria blanca, mucoide en los medios convencionales, que resultó patogénica; de las muestras correspondientes a enero de 1988 se aisló una colonia blanca que en el medio agar nutritivo con el tiempo se tornaba blanco-marrón. No se aislaron bacterias fitopatógenas en las muestras correspondientes a octubre de 1987. La primera colonia aislada de color blanco mucoide, elevada, bordes enteros, se perdió por causas ajenas a nuestra voluntad. La colonia que en AN se tornaba blanco-marrón era opaca de bordes enteros, no traslúcida, elevada y mucoide, pero en los medios agar extracto de levadura y carbonato de calcio tomaba una coloración blanco-amarillo-verdoso a las 48-72 horas de crecimiento; al microscópio óptico la bacteria tenía forma de bastón, fue Gram negativa, KOH al 3% positiva, aeróbica, oxidasa negativa, arginina negativa, fluorescente en el medio B de King, catalasa positiva, agar dextrosa rojo fenol positiva, licuó la gelatina, creció hasta 5% en sales de NaCl, creció a 4°C, a 36°C y en el medio M71 de Leben con las colonias características para Pseudomonas; no disolvió el almidón, no produjo H2S y no produjo pudrición en rodajas de papa. Este aislamiento bacteriano produjo síntomas parecidos a los observados inicialmente en tapiramo con la inoculación proveniente de las muestras de semillas (manchas acuosas en diferentes partes de la hoja, irregulares, que luego se tornaban necróticas de color marrón) en las plantas de caraota, tapiramo y frijol, y una reacción más suave, manchas a lo largo de la lámina foliar de pocos milímetros en sorgo. De toda esta sintomatología se pudo aislar nuevamente la colonia original descrita, la bacteria dió la reacción de la hipersensibilidad en tabaco.

DISCUSION

El hecho de resultar Gram negativa, KOH al 3% positiva, aeróbica con forma de bastón, oxidasa negativa, arginina dihydrolasa negativa que no pudre la papa, da positiva la reacción de hipersensibilidad en tabaco, creció en el medio M71 de Leben citado por APS (1980), nos conduce, de acuerdo a Billing (1970 a, b), Broklehurst y Lund (1981), Fahy (1981), Lelliot et al. (1966), Sands et al (1980) a concluir que estamos en presencia de una Pseudomona del grupo fluorescente, de la especie syringae.

En el grupo de Pseudomonas syringae existen variantes patogénicas (Pathovars) que infectan leguminosas; tenemos en caraota Ps. syringae pv. phaseolicola (Vock, 1978), en soya Ps. syringae pv. glycinea (Moffet, 1976). El rango de huéspedes de estas dos bacterias es bastante similar, sin embargo ellas se diferencian radicalmente en la sintomatología producida en relación a nuestro aislamiento patogénico. Estos dos patovares producen clorosis alrededor de la mancha donde se multiplica la bacteria debido, en el caso de Ps. syringae. pv. phaseolicola a la toxina phaseolotoxin y en el caso de Ps. syringae. pv. glycinea a la toxina coronatina (Mitchell, 1982).

En nuestro aislamiento en caraota, tapiramo y frijol fue característica la producción de manchas acuosas, que luego pasaban a un color rojo-necrótico y se observaba, alrededor de dichas lesiones, poco o ningun halo clorótico. También se producían con facilidad síntomas en sorgo. El rango de huéspedes no coincide con el señalado para las bacterias citadas anteriormente, y tampoco para Ps. syringae pv. pisi según Stapp (1961), Fahy y Persley (1983). Sin embargo el tipo de colonia, la coloración blanco-amarillo-verdosa en los medios utilizados, la sintomatología, el rango de huéspedes, etc. coinciden con lo señalado para la bacteria Pseudomonas syringae pv. syringae por Stapp (1961), Harrison y Freeman (1965), Vock (1978). Esta bacteria produce en caraota y tapiramo, la llamada mancha marrón de la caraota y tapiramo, de acuerdo a Zaumeyer y Thomas (1957), los cuales señalan la existencia de una raza suave aislada del frijol; Stapp (1961) ya señala que el patógeno es transmitido vía semilla y es citado como patógeno causante de una enfermedad importante en los campos de caraota australianos (Harrison y Freeman, 1965), y en los Estados Unidos de Norteamérica (Hertink et al. 1967). No encontramos señalamientos de que el aislamiento de este patógeno provoque con el tiempo el color marrón en AN, tal vez se trate de nuestro aislamiento local. Es interesante señalar que Oliveros, Trujillo y Gómez (1987) encontraron semillas de canavalia (Canavalia ensiformis) con una sintomatología de manchas producidas por Ps. syringae, también se conoce en Venezuela la mancha bacterial del sorgo causada por Ps. syringae pv. syringae (Hernández et al.,1987), el tizón bacterial de la soya causado por Pseudomonas syringae pv. glicinea (Mizrahi, 1985), pero la enfermedad encontrada no se conocía anteriormente. Es interesante señalar que este patógeno es transmitido de planta a planta por el salpique de las lluvias y es favorecido por la alta humedad y las bajas temperaturas (Fahy y Persley, 1983). Este último factor con seguridad condiciona su efecto en Venezuela sólo en determinadas zonas.

Por todo lo expresado anteriormente se considera necesario dedicar esfuerzos y recursos al estudio de la patología bacteriológica de las semillas tomando en cuenta su importancia económica y lo poco que se conoce en el país al respecto.

LITERATURA CITADA

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