LA QUEMAZON BACTERIANA DE LA CARAOTA (Phaseolus vulgaris L.) EN VENEZUELA

MAURO ALBARRACIN*; GUSTAVO E. TRUJILLO**; ORANGEL BORGES**

COMPENDIO

En un estudio para determinar la presencia de la quemazón bacteriana de la caraota (Phaseolus vulgaris L.) se visitaron campos de los Estados: Aragua (Cagua, Maracay y Villa de Cura), Anzoátegui (El Tigre), Carabobo (Güigüe) y Yaracuy (Guarabao), donde se recolectaron 35 muestras sospechosas de estar atacadas por la enfermedad, de las cuales se realizaron 22 aislamientos de la bacteria de la quemazón. La incidencia de la enfermedad varió de una localidad a otra, pero la enfermedad estuvo presente en todas las localidades. Los aislamientos de la bacteria fueron estudiados individualmente sobre diferentes medios de cultivo, se realizaron pruebas de patogenicidad, estudios de características culturales, pruebas bioquímicas y se observaron al microscopio electrónico. Todas las pruebas anteriores concuerdan con lo señalado para la bacteria Xanthomonas campestris pv. phaseoli. En aislamientos realizados en muestras de Maracay y El Tigre, se encontró la presencia de la variante fuscans, la cual se describe por primera vez en el país. Esta variante se caracteriza por la producción de una coloración marrón en los medios de cultivo, dicha coloración es inhibida cuando el medio contiene glucosa.

ABSTRACT

INTRODUCCION

El agente causal de la quemazón bacteriana de la caraota (Phaseolus vulgaris L.) es la bacteria Xanthomonas campestris pv. phaseoli Dye (9), conocida anteriormente con el nombre Xanthomonas phaseoli (E. F. Sm.) Dows. y Xanthomonas phaseoli var. fuscans (Burkh). Starr y Burkh, las cuales causan la principal enfermedad de este cultivo en el mundo.

Esta bacteria se encuentra ampliamente distribuida en zonas productoras de caraota en el mundo, tales como: Australia, Bulgaria, Canadá, China, España, Estados Unidos de Norteamérica, Filipinas, Francia, Hungría, Japón, Madagascar, Noruega, Rusia, Sur Africa, Turquía, Uruguay y Yugoeslavia (22), Brasil (16), Chile (17), Costa Rica (13), México (6), Nueva Zelandia (20) y Venezuela (18).

La presencia de Xanthomonas phaseoli (Xp) fue señalada por primera vez en Venezuela por PONTIS VIDELA en 1954 (18), desde entonces es poco lo que se ha realizado para el conocimiento de este patógeno. VEGAS lo cita de importancia en el país (19) y DIAZ POLANCO (7) en 1971 estudia el efecto sinergístico de Xp. y Macrophomina phaseoli en caraota, encontrando que el daño ocasionado por los dos patógenos en asociación es más extenso y grave que la acción simple o aditiva de sus componentes. Reporta el mismo autor la presencia de la enfermedad en los Estados Falcón y Portuguesa.

Sobre la presencia de Xanthomonas phaseoli var. fuscans, la información es sumamente pobre. Díaz Polanco y G. de Díaz Polanco (8) citan un trabajo en su lista de patógenos en las plantas cultivadas en Venezuela que nunca fue publicado, sin embargo, el citado autor sostiene haber estado en contacto con esta bacteriosis*.

El presente trabajo tiene como objetivos: Determinar la posible presencia de esta enfermedad en diversas zonas productoras de caraota del país; obtener aislamientos puros del patógeno que sirvan para realizar una identificación completa del mismo y para futuros trabajos en relación con esta enfermedad.

Un adelanto de parte de este trabajo ya ha sido publicado.(1)

MATERIALES Y METODOS

Se recolectaron muestras de hojas de caraota negra (Phaseolus vulgaris L.) que mostraban síntomas parecidos a los de la enfermedad conocida como "quemazón de la caraota" de los siguientes Estados: Estado Aragua: Cataurito, Cagua, campos de la Facultad de Agronomía U.C.V. Maracay. En el Estado Anzoátegui: la zona de El Tigre. En el Estado Carabobo: la zona de Güigüe; y en el Estado Yaracuy: la zona de Guarabao. Las muestras fueron recolectadas al azar sobre cada uno de los campos, siendo colocadas extendidas entre hojas de papel periódico y trasladadas al laboratorio, donde se realizaron los aislamientos respectivos después de 3-5 días.

Fueron realizados de hojas que mostraban manchas típicas de la enfermedad, las muestras seleccionadas eran lavadas con agua destilada estéril, desinfectadas con alcohol al 40% por 2-3 minutos y nuevamente lavadas con agua estéril, se seleccionaba la parte amarillo limón de la mancha, la cual era seccionada con un bisturí estéril, la parte seccionada era macerada en un mortero estéril con agua destilada estéril.

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El macerado resultante fue tratado de dos modos:

a) Un ansa de platino estéril se introducía en el macerado y se transfería a placas de petri con medio de cultivo, mediante el estriado por agotamiento, para tratar de obtener colonias aisladas.

b) Se tomó 1 cc del macerado y se realizó una dilución seriada del mismo en tubos que contenían 9 cc de agua destilada estéril, de cada tubo de la dilución eran tomadas muestras de 0,1 cc, las cuales eran sembradas en cajas de petri con medio de cultivo, a fin de obtener colonias aisladas.

Las colonias aisladas obtenidas por ambos métodos se replicaban en medios de cultivos y a las 48 horas se les hacía la tinción de Gram.

Para la caracterización fisiológica de la bacteria se utilizaron los siguientes medios de cultivo (10, 12, 13, 15): Agar nutritivo (AN), Agar papa dextrosa (PDA), Medio B de King (KM), Medio para la producción de H2 S, Medio para determinar los requerimientos de oxígeno, Medio para fermentación de carbohidratos, Medio para obtener hidrólisis de la gelatina y Agar rojo fenol dextrosa.

Se utilizaron plantas sanas de caraota negra, cultivar susceptible proveniente de Güigüe, sembradas en bolsas de polietileno de 2 kg de capacidad llenas de tierra esterilizada con bromuro de metilo, las plantas eran mantenidas en condiciones de umbráculo, hasta presentar la primera hoja trifoliada completamente desarrollada (14-21 días después de sembradas).

Para preparar el inóculo de los aislamientos a probar, éstos crecieron por 48 horas sobre el medio YCA, y luego fueron lavados con agua destilada estéril, la suspensión obtenida se diluyó hasta 125 ml por placa de cultivo.

Se utilizaron dos métodos de inoculación: el primero consistió en una aspersión de la suspensión bacteriana al follaje de la planta con una bomba manual. El segundo método consistió en inyectar en el tallo cerca del punto de crecimiento la misma suspensión bacteriana usando una jeringa desechable con aguja 21G, para cada uno de los aislamientos y por cada método se utilizaron 6 plantas, además se inyectaron o asperjaron 3 plantas con agua destilada para que sirviesen de testigos.

Después de inoculadas las plantas fueron colocadas en cámara húmeda por 48 horas (30 ± 2ºC y HR 95%). Luego las plantas fueron colocadas en condiciones de umbráculo, regadas diariamente y observadas hasta la aparición de síntomas.

Tanto de las plantas inyectadas como asperjadas con los diferentes aislamientos que resultaron patogénicos, se realizaron reaislamientos para corroborar si efectivamente era la bacteria inoculada, la responsable de los síntomas producidos.

Se observó la forma de la bacteria y la presencia y ubicación de flagelos mediante la observación al microscopio electrónico, utilizando la técnica de enjuague.

RESULTADOS

Síntomas de la enfermedad fueron observados en todas las zonas productoras visitadas, estos síntomas estuvieron siempre presentes en las hojas de las plantas, pero nunca en las vainas de las mismas. Consistieron en manchas necróticas de color marrón, bordeadas por un halo amarillo; en muchos casos fue observado por el enves de las hojas puntos acuosos, con aspecto de exudado.

De 35 muestras recolectadas en las diferentes zonas, todas produjeron colonias amarillo ambar sobre PDA; sin embargo, sólo fue posible, por problemas de contaminación, realizar 22 aislamientos (Cuadro 1) sospechosos de ser patogénicos los cuales resultaron ser patogénicos al ser inoculados sobre plantas de caraota, la inoculación fue realizada por aspersión o por inyección.

Cuando las plantas fueron asperjadas en su follaje con la suspensión bacteriana, los síntomas aparecieron 10-14 días después y se repitió la sintomatología observada en el campo; con el método de la inyección los síntomas se observaron 5-7 días después de inyectadas las plantas, observándose necrosamiento en el punto de inyección y en algunos casos exudado bacteriano, también necrosamiento del punto de crecimiento de la planta, como de las hojas superiores al punto de inyección. Por lo general las plantas mueren en un período de 20 días.

CUADRO 1. Número de aislamientos de la bacteria causante de la quemazón de la caraota obtenidos de diferentes localidades como colonias individuales y algunas de sus características

Hojas de caraota mostrando los síntomas típicos de la quemazón de la caraota.

Aislamiento de Xanthomonas campestris p.v. phaseoli creciendo sobre agar papa dextrosa, T2P es la variante común y T2 es la variante fisiológica fusco.

Las plantas asperjadas o inyectadas como control, con agua destilada, en ningún momento presentaron ninguno de los síntomas señalados anteriormente, permaneciendo sanas durante todo el experimento.

Todos los aislamientos que resultaron patogénicos resultaron Gram negativos y vistos al microscopio electrónico presentaban una célula bacteriana en forma de bastón con un flagelo polar.

Todos los aislamientos obtenidos crecieron bien en los medios AN, KM, YCA y PDA. Cuando los aislamientos crecieron sobre PDA (conteniendo 20 g de dextrosa), la coloración de los mismos fue amarillo ámbar, cuando crecieron sobre los medios AN, KM y YCA, la coloración amarillo ámbar fue común inicialmente (24-48 hr) para todos los aislamientos, sin embargo se observó que cinco aislamientos provenientes de muestras de El Tigre, Edo. Anzoátegui y uno de Maracay, Edo. Aragua, comenzaban después 24-48 hr a producir un cambio de coloración en el medio de cultivo, tornándolo completamente marrón, mientras que el resto de los aislamientos mantenía su coloración inicial.

En la prueba de fermentación de carbohidratos todos los aislamientos utilizaron en forma positiva los carbohidratos: glucosa, galactosa, sacarosa, arabinosa, fructosa, glicerol, lactosa, maltosa (Cuadro 2). En cuanto a la hidrólisis del almidón, todos resultaron positivos, también produjeron H2 S y necesitaron oxígeno para su metabolismo, resultaron negativos en la prueba con Agar dextrosa rojo fenol (Cuadro 2), lo que significa que la reacción fue alcalina.

DISCUSION

La presencia de la bacteria en las zonas visitadas de los Estados: Aragua, Anzoátegui, Carabobo y Yaracuy, indican que la quemazón de la caraota es una enfermedad de amplia distribución en el país, ya que conocíamos, para 1971 (11), de su presencia en los Estados Falcón y Portuguesa.

CUADRO 2. Pruebas de identificación realizadas a aislamientos de la bacteria causante de la quemazón de la caraota. *

Los síntomas observados en el campo concuerdan con los descritos en la: literatura (21). Estos síntomas pudieron reproducirse en condiciones de umbráculo mediante inoculaciones artificiales y de las plantas inoculadas se pudo reaislar el mismo patógeno, lo cual nos permite cumplir con los postulados de Koch (14).

La caracterización tanto patológica como fisiológica nos permiten señalar que efectivamente las bacterias aisladas pertenecen al género Xanthomonas, ya que todas las pruebas realizadas concuerdan con las descritas en la literatura para este género (6, 10, 12, 13).

La característica de producción de un pigmento melanoide color marrón difusible en el medio de cultivo, por parte de algunos aislamientos (2) y la inhibición de la producción de este pigmento cuando el medio contiene glucosa (2, 3, 4) unido a las pruebas de patogenicidad y pruebas fisiológicas nos permiten señalar por primera vez en el país, la presencia de Xanthomonas phaseoli var. fuscans (Xpf) como uno de los patógenos causantes de la quemazón de la caraota.

Aislamiento de Xanthomonas campestris p.v. phaseoli creciendo sobre agar extracto de levadura y CaCO₃ , note la coloración marrón producida por la variante Fisiológica fusco, (T2).

Foto al microscopio electrónico de varias células de bacteria Xanthomonas campestris p.v. phaseoli. Note el flagelo polar.

La presencia de Xpf fue predominante en muestras provenientes de El Tigre y de Maracay.

Estas dos variantes, según las nuevas reglas de nomenclatura (9, 11), deben ser citadas como Xanthomonas campestris pv. phaseoli Dye 1978.

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