PURIFICACION PARCIAL Y CARACTERIZACION CINETICA DE LA POLIFENOL OXIDASA DEL CAMBUR MANZANO (Musa [AAB] cv. 'manzano')*

SUMARIO

El objetivo de este trabajo fue el de obtener información sobre algunas características cinéticas de la Polifenol oxidasa del cambur manzano (Musa [AAB] cv. 'manzano). Se preparó un extracto crudo mediante disolución en un buffer 0,1 M en fosfato a pH 6,2; precipitación con acetone fría y redisolución en un buffer 0,01 M en fosfato a pH 6,2. La actividad específica del extracto crudo fue de 5,0 a 6,0 A420nm min x mg E. El pH óptimo de la enzima se encuentra entre valores de 6,5 a 6,ó. De los sustratos estudiados, el mejor resultó ser la dopamina con una relación Vmax/Km de 6,72. La enzima es sumamente resistente a la acción del calor. El calentamiento a 60°C durante una hora sólo redujo su actividad en un 12,5% mientras que su t1/2 a 75°C es de 10 minutos. La PFO del cambur manzano tiene su máxima actividad dentro del rango de temperatura de 35 a 45°C. Los valores Q10 para la oxidación del catecol son: Q10 (10-20°C) =1,67; Q10 (20-30°C) =1,30; Q10 (30-40°C) =1,10. Se estudió el efecto del NaCl, del ácido ascórbico y del metabisulfito de sodio sobre la actividad de la enzima. Los dos últimos inhibidores, además de causar una disminución en la actividad de la enzima, provocaron un retardo en el inicio de la reacción. El ácido ascórbico a una concentración 4 x 1O-4 M produjo un 77,3% de disminución en la actividad de la PFO. Por su parte, el metabisulfito de sodio, a una concentración de 2,66 x 10-4 M inhibió un 63,7% de la actividad. Esto significa que las dos sustancias son buenos inhibidores de la enzima. El NaCI por el contrario no es tan efectivo, pues se requirió una concentración de 5% para reducir la actividad de la enzima en un 50%.

SUMMARY

INTRODUCCION

El oscurecimiento o pardeamiento enzimático ( "enzymatic browning" ) constituye uno de los principales problemas durante la conservación y el procesamiento industrial de algunas frutas y hortalizas. Paralelamente con la alteración del colar, se producer cambios en el sabor y pérdidas apreciables del valor nutricional de estos alimentos. Este proceso indeseable es debido a la oxidación de compuestos fenólicos, en reacción catalizada por la enzima Polifenol oxidasa (PFO) (o-difenol: 02 oxidoreductasa. EC 1.10.3.1). Otros nombres dados a esta enzima son los de fenolasa, fenol oxidasa, tirosinasa, catecolasa, oxidasa del ácido clorogénico, etc.

La polifenol oxidasa presente en frutas de clima templado, como la manzana12 pera 11,13 duraznos,10, 14 cerezas,2 etc., han sido adecuadamente estudiadas. Por el contrario, muy poca investigación ha sido realizada con la enzima presente en frutas tropicales y particularmente en frutas venezolanas.

A los fines del control o prevención del oscurecimiento enzimático, es necesario conocer ampliamente las características de la enzima y de las reacciones por ella catalizadas. Sobre todo, es de especial importancia conocer la influencia sobre la actividad de la enzima de factores tales como el pH, la temperatura, los sustratos, los inhibidores, etc.

Este trabajo tuvo como objetivo caracterizar cinéticamente la PFO presente en el cambur manzano, el cual es una fruta de cierta popularidad para consumo fresco. El estudio es parte del proyecto de investigación "Estudios enzimológicos en frutas y hortalizas criollas", el cual es financiado por el Consejo de Desarrollo Científico y Humanístico de la UCV.

MATERIALES Y METODOS

Las muestras utilizadas en este trabajo fueron adquiridas en fruterías de la ciudad de Maracay.

En una licuadora se homogeneizaron porciones de 100 g de la fruta madura y pelada con 200 ml. de buffer fosfato 0,1 M, pH 6,2, el cual contenía ácido ascórbico en concentración 0,03 M. El agente reductor es usado con el fin de prevenir el oscurecimiento durante la extracción de la enzima. El macerado fue centrifugado por 30 minutos a 16.319 g en una centrífuga refrigerada Sorvall RC-2B y el sobrenadante fue filtrado a través de lana de vidrio. Al extracto se le añadió doble volumen de acetona enfriada a-10°C, en pequeñas porciones y con agitación. El precipitado formado fue separado mediante centrifugación a 653 g por 15 minutos y suspendido en 80 ml de buffer fosfato 0,01 M, pH 6,2. Por último, se centrifugó durante 30 minutos a 12.062 g y el sobrenadante constituyó el extracto enzimático utilizado en el trabajo cinético. Durante todas las operaciones de extracción, la enzima se mantuvo a temperatures inferiores a 4°C.

La actividad de la enzima fue determinada mediante el método colorimétrico de PONTING Y JOSLYN,9 modificado en la forma siguiente: el sustrato usado fue catecol en buffer fosfato 0,01 M, pH 6,2. El cambio en absorbancia a 420 mm en función del tiempo, originado al mezclar el sustrato con la enzima, fue registrado en un espectrofotómetro Perkin-Elmer 124 acoplado a un registrador Radiometer REC 61. Las veloeidades iniciales de reacción

( A420 ) min fueron calculadas a partir de las pendientes de la

porción inicial de las curvas de actividad. El volumen de reacción fue 3,0 ml y se requirieron 0,05-0,10 ml de extracto enzimático para el ensayo.

La concentración de proteína en los extractos enzimáticos fue determinada por el método de LOWRY "et al".7 usando albúmina de suero de bovino cristalizada como standard.

La actividad enzimática en función del pH fue determinada mediante el ensayo colorimétrico, usando como sustrato catecol 0,01M en buffer citrato 0,1M - fosfato 0,2 M a 30°C. El rango de pH usado fue de 3,1 a 7,4.

Como posibles sustratos de la PFO extraída del cambur manzano fueron estudiados el catecol, el ácido clorogénico, la dopamina y el ácido cafeico. Los rangos de concentraciones usados fueron: catecol 4-100 mM, ácido clorogénico 1,4-10 mM, dopamina 0,5-15 mM. Los valores de las constantes cinéticas Km y Vmax se calcularon mediante el método gráfico de LINEWEAVER-BURK.6

Se determinó el efecto de la temperatura sobre la actividad de la enzima. Para la realización del experimento se utilizó el espectrofotómetro Perkin-Elmer 124 con el compartimiento de celda termostatatado a diferentes valores de temperatura, dentro del rango 10-49ºC. El sustrato usado fue catecol 0,01 M en buffer fosfato 0,0l M, pH 6,2. Se usó como mezcla de reacción 2,95 ml de sustrato y 0,05 ml de enzima.

Se colocaron alícuotas de 0,3 ml del extracto enzimático en tubos de ensayo (10x75 mm) y se incubaron a 60°C ó 75°C durante 10, 20, 30, 40, 50 y 60 minutos. Inmediatamente después del tratamiento calórico, las muestras fueron enfriadas mediante inmersión en una mezcla agua-hielo.

La actividad residual fue determinada a 30°C y pH 6,5, usando el método colorimétrico.

Se estudió la inhibición de la enzima por el ácido ascórbico, el cloruro de sodio y el metabisulfito de sodio. Las concentraciones del inhibidor fueron: ácido ascórbico 1, 2, 3 y 4 x 10-4 M. Cloruro de sodio 2,4, 6 y 8%. Metabisulfito de sodio 0,66; 1,33; 2,00 y 2,66 x 10 4 M. En todos los casos el sustrato fue catecol 0,01 M en buffer fosfato 0,01 M, pH 6,2. La actividad enzimática se determinó mediante el método colorimétrico, a una temperature de 30°C.

RESULTADOS Y DISCUSION

El cambur manzano posee una fuerte actividad de la Polifenol oxidasa. El extracto crudo obtenido mediante suspensión en buffer fosfato, precipitación con acetona fría y redisolución en el mismo buffer, presentó una actividad específica de 5,0 a 6,0 .A 420 nm/ min x mg E con catecol 0,01 M en buffer fosfato pH 6,2 como sustrato y temperatura de 25°C.

La Fig. 1 muestra el efecto del pH sobre la actividad de la PFO extraída del cambur manzano. El pH óptimo se encuentra entre 6,5 y 6,6, produciéndose una caída brusca de la actividad tanto hacia el lado ácido como hacia el básico. Se puede observer también un plateau entre los pH 3,5 y 4,0. Se han reportado valores diferentes de pH óptimo para las PFO presentes en plantas. WONG "et al"14 reportan valores de máxima actividad a pH 6,5; 6,8; 7,2 y 7,0 para cuatro isozimas aisladas de duraznos. GREGORY Y BENDALL 3 estudiaron el efecto del pH sobre la actividad de la PFO del té y obtuvieron un pH óptimo dé 5,7 con pirogalol y de 5,0 con metil catecol. ALBERGHINA 1 encontró un máximo a pH 4,3 y un plateau entre los pH 5 y 6 en la oxidación del ácido clorogénico por la PFO de papas. PALMER8 determinó un pH óptimo de 7,0 para la oxidación de la dopamina, catalizada por la PFO de bananas "GROS Michel".

Fig. 1. Efecto del pH sobre la actividad de la polifenol oxidasa extraída del cambur manzano

Las Figuras 2 y 3 y el Cuadro N° 1 muestran los resultados del estudio de la especificidad de sustrato de la PFO del cambur manzano. Los valores de la relación Vmax/Km indican que de las sustancias estudiadas, la dopamina resultó el mejor sustrato para la enzima. Esto confirma las experiencias realizadas por GRIFFITHS4 y PALMER.8

Fig. 2. Gráfico de Lineweaver-Burk para la oxidación del ácido clorogénico, catalizada por la polifenol oxidasa del cambur manzano I/,(S), M-l

Fig. 3. Gráfico de Lineweaver-Burk. para la oxidación de la dopamina, catalizada por la polifenol oxida da del cambur manzano

CUADRO 1. ESPECIFICIDAD DE SUSTRATO DE LA POLIFENOL OXIDASA DEL CAMBUR MANZANO

La actividad de la enzima en función de la temperatura se presenta en el Cuadro N° 2 y en la Figura 4. Se puede observar que la mayor actividad se encuentra entre los 35 y 45°C, produciéndose una disminución a partir del último valor, como consecuencia de la desnaturalización de la enzima. Los valores Q10 para la reacción fueron los siguientes: Q10 (10-20°C) =1,67; Q10 (20-30°C) =1,30; Q10 (30- 40°) =1.10.

Fig. 4. Actividad de la polifenol oxidasa extraída del cambur manzano, en función de la temperatura

La PFO del cambur manzano es sumamente resistente a la acción del calor (ver la Figura 5). El calentamiento a 60°C durante una hora sólo redujo su actividad en un 12,5% mientras que su t1/2 a 75°C es de 10 minutos. En este sentido, la enzima estudiada tiene una termorresistencia comparable a la reportada para la PFO de las peras BARTLETT.11

CUADRO 2. EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA PFO DEL CAMBUR MANZANO

Fig. 5. Efecto del calor sobre la actividad de la polifenol oxidasa extraída del cambur manzano

El ácido ascórbico, el cloruro de sodio y los sulfitos son los inhibidores más utilizados pare prevenir el oscurecimiento enzimático de las frutas y hortalizas durante su utilización industrial.

Dos de los tres inhihidores estudiados, el ácido ascórbico y el metabisulfito de sodio, además de causar una disminución en la actividad de la enzima, provocaron un retardo en el inicio de la reacción. El ácido ascórbico, a una concentración 4 x 1O-4 M, produjo un 77,3% de inhibición de la actividad de la PFO extraída del cambur manzano (ver el Cuadro N° 3). Por su parte, el metabisulfito de sodio en una concentración de 2,66 x 10- 4 M inhibió un 63,7% de la actividad. Eso significa que estas dos sustancias son fuertes inhibidores de la enzima bajo estudio.

El efecto del cloruro de sodio es también presentado en el cuadro N° 3. Como puede observarse se requirió 5% de esta sustancia para reducir la actividad de la enzima en aproximadamente un 50%. Resultados parecidos han sido reportados pare la PFO extraída de otras frutas y hortalizas.2,5,14

CUADRO 3. EFECTO DE DIFERENTES INHIBIDORES SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA PFO DEL CAMBUR MANZANO

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

1. ALBERGHINA, F. A. M. Chlorogenic acid oxidase from potato tuber slices: Partial purification and properties. Phytochemistry. 3 :65. 1964.
2. BENJAMIN, N. D. M. W. MONTGOMERY. Polyphenol oxidase of Royal Ann cherries. Purification and characterization. J. Food Sc. 38:799. 1973. slices: Partial purification and properties. Phytochemistry. 3:65.
3. GREGORY, R. P. F. and D. S. BENDALL. The purification and some properties of the polyphenol oxidase from tea (Camellia sinensis L.) Biochem. J. 101:569. 1966.
4. GRIFFITHS, L. A. Detection and identification of the polyphenol oxidase substrate of the banana. Nature 184:58. 1959.
5. KNAPP, F. W. Browning enzymes of eggplant. Fla. State Hort. Soc. 74:256. 1956.
6. LINEWEANVER, H. and D. BURK. The determination of enzyme dissociation constants J. Am. Chem. Soc. 56:685. 1934.
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8. PALMER, J. K. Banana polyphenoloxidase; preparation and properties. Plant Physiol. 38:508. 1963.
9. PONTING, J. D. and M. A. JOSLYN. Ascorbic acid oxidation and browning in apple tissue extracts. Arch. Biochem. Biophys. 19:49. 1948.
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11. RIVAS, N. and J. R. WHITAKER. Purification and some properties of two Polyphenol oxidases from Bartlett pears. Plant Physiol. 59:501. 1973.
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13. TATE, J. N., B. S. LUH and G. K. YORK. Polyphenol oxidase in Bartlett pears. J. Food Sc. 29:829. 1964.
14. WONG, T. C., B. S. LUH and J. R. WHITAKER. Isolation and charaeterization of Polyphenol oxidase isozymes of clingstone peach. Plant Physiol. 48:19. 1971.