AISLAMIENTO, AUTENTICACION Y EFECTIVIDAD DE DOS CEPAS DE RHIZOBIUM DE FRIJOL (Vigna sinensis L. SAVI) *

COMPENDIO

En este trabajo se presenta un estudio inicial del Rhizobium nativo de frijol (Vigna sinensis L Savi). Se aislaron dos cepas nodulantes, las cuales se autenticaron aplicando los postulados de Koch y se les midió su efectividad a través de las siguientes variables: crecimiento longitudinal del tallo, área foliar total, peso seco de la parte aérea, peso seco de la parte radicular, agua total consumida, contenido de nitrógeno en la parte aérea y contenido de nitrógeno en la parte radicular. En el cultivo de las plantas se utilizó el método modificado de la botella-jarra de Leonard.

ABSTRACT

INTRODUCCION

Desde tiempos muy remotos es conocida la capacidad que tienen las leguminosas de restaurar o mantener la fertilidad de los suelos; sin embargo, es a mediados del siglo XX, con el desarrollo de los métodos de análisis químicos, que se pudo demostrar que los suelos pobres, sembrados con leguminosas, ganaban nitrógeno. Este fenómeno no

es una propiedad como tal de estas plantas, sino que es el resultado de una infección producida en las raíces por bacterias del suelo, pertenecientes al género Rhizobium, la cual se manifiesta a través del desarrollo de estructuras abultadas, denominadas nódulos, enigma que fue aclarado en 1886 por HELLRIEGEL y WILFARTH (SERVICI de RONDINT, 1952; NUTMAN, 1965). En 1888 BEIJERINCK aisla y cultiva las bacterias de las nudosidades y demuestra que las semillas no infectadas, producen los abultamientos característicos, si se las trata con cultivos puros de las bacterias aisladas (STANIER, DOUDOROFF y ADELBERG, 1970). A partir de 1896, se hace práctica común la inoculación de semillas con cultivos artificiales de Rhizobium, desarrollados en medios agarificados, que todavía se utilizan, pero en menor escala, debido al incremento en la producción de inoculantes comerciales, en cuya elaboración se utilizó fundamentalmente la turba, como portador del inóculo y variadas sustancias para revestir las semillas inoculadas (BROCKWELL, 1962; LONERAGAN et al 1955; ROUGHLEY, 1970; ROUGHLEY and VINCENT, 1967; SCHIEL et al, 1970; DATE, 1970).

La cantidad de nitrógeno fijado en un determinado cultivo está afectada por factores diversos (VINCENT, 1965; AHMED and EVANS, 1960; HELY et al, 1957; LONERAGAN and DOWLING, 1958; WILSON and REISENAWER, 1970; NUTMAN, 1972); sin embargo, en una leguminosa efectivamente nodulada y creciendo vigorosamente, el Rhizobium puede proporcionarle, a través de la actividad de los nódulos, todo el nitrógeno que necesita, aun cuando el elemento no esté disponible en el suelo (NUTMAN, 1965). Un aspecto interesante de esta simbiosis bacteria-planta y que puede ser de mucha importancia en las asociaciones gramíneas-leguminosas, ha sido mostrado por VEST (1971), quien trabajando con soya, consiguió que plantas no noduladas, por su proximidad se beneficiaran en terminos de rendimiento en grano, porcentaje de proteína en la semilla y tamaño y número de semillas, del nitrógeno fijado en plantas noduladas. Lo que no esta todavia claro es si tales efectos son debidos a las excreciones, a través de las raíces, de sustancias nitrogenadas, a la desintegración de nódulos o a la reducida competencia de las plantas noduladas, por el nitrógeno disponible en el suelo.

El proceso simbiótico de fijación del nitrógeno atmosférico puede considerarse una vía para reducir el uso de los fertilizantes nitrogenados químicos, los que día a día tienden a ser más costosos, además se ha sugerido un uso más extenso de las leguminosas, como una ayuda para solucionar el problema de la escasez de proteínas a nivel mundial (DAWSON, 1970); ello puede ser explicado a través de las estimaciones da MACGILLIVRAY and BOSLEY (1962) sobre las cantidades de aminoácidos esenciales, que en una unidad de sierra pueden ser producidos por leguminosas, no leguminosas y productos animales. Cada uno de los 8 aminoácidos esenciales pueden ser producidos más eficientemente a través de las leguminosas y si se considera conjuntamente a los 8 aminoácidos, se puede estimar que 17.9 Kg/Ha, 14.6 Kg/Ha, y 10.1 Kg/Ha, pueden ser producidos por soya, guisantes

secos y frijoles secos respectivamente; mientras que la fuente animal puede producir 1 Kg/Ha de aminoácidos esenciales, calculados para cerdo, res y cordero.

Lo dicho anteriormente resume la importancia que tiene cualquier estudio relacionado con la simbiosis Rhizobium leguminosa.

De acuerdo con la revisión realizada, se puede decir que los trabajos existentes en el país son escasos (SAVOSTIN, 1950; GARASSINI, 1951; IYER, 1972; AVILA LOZANO, 1971; AYALA, 1974), ello indica que el campo de la Rhizobiología ha sido poco explorado, en nuestras condiciones, a pesar de la gran importancia que ello podría tener.

El presente trabajo persigue una evaluación inicial de las cepas nativas de Rhizobium; se ha seleccionado como leguminosa al frío por dos aspectos importantes: por ser un cultivo de gran demanda en nuestro país, al punto de estar sujeto a importaciones, las cuales fueron para el año 1972 de aproximadamente 7.760 Tm. (Venezuela, 1974 y por ser un material rústico, de fácil acceso y muy bueno para trabajar en condiciones de laboratorio.

MATERIALES Y METODOS

La ejecución del presente trabajo se realizó en tres etapas consecutivas:

I. AISLAMIENTO DE BACTERIAS NODULANTES

De una parcela sembrada de frijol, var. Arauca, * situada cerca del laboratorio de la Sección de Microbiología de la Facultad de Agronomía de la Universidad Central de Venezuela (suelos correspondientes a la serie Maracay), se seleccionaron por vigor y aspecto diez plantas de un mes de edad. De cada planta se tomaron dos nódulos que so habían desarrollado en la raíz principal. Para esta operación, los nódulos se separaron, llevando adherida una pequeña porción de la raíz. El material seleccionado fue lavado con agua corriente, y se colocó en una fiola estéril de 100 ml. Se agregó bicloruro de mercurio al 0,2 por ciento (2 g/l) y se les mantuvo durante 4 minutos en agitación permanente. Se eliminó el bicloruro de mercurio y se lavaron los nódulos por 10 veces consecutivas con agua destilada estéril. Con una aguja de disección, humedecida en alcohol, esterilizada al rojo en la llama del mechero y enfriada, se punzó cada nódulo y se colocó en tubos d" ensayo (150 x 18 mm) que contenían en forma de cuña el medio de cultivo Extracto de levadura-Manitol-Agar (Y.M.A.) con rojo Congo (recomendado por KLECZKOWSKA et al, 1968) presionándolo para romperlo y facilitar la salida de las bacterias al medio, colocándose la superficie partida del nódulo en contacto directo con el medio de cultivo. Los tubos así sembrados fueron incubados a 27° C por l'5 días. Posteriormente, el material biológico que se desarrolló en cada tubo fue sembrado por el método de estriación por agota

* Semilla suministrada por el Dr. Alfredo Barrios (CENIAP, Maracay).

miento en tres cajas de Petri (100 x 15 mm) preparadas previamente con Y.M.A. con rojo Congo. Se incubó a 27° C por 15 días, observándose periódicamente, con el fin de aislar las colonias que presentaban un desarrollo acorde con el crecimiento esperado de Rhizobium, según lo señalado por KLECZKOWSKA et al (1968). Cada colonia típica fue aislada en tubos con cuñas de Y.M.A. con rojo Congo y se les identificó como "presunto Rhizobium". Este término fue utilizado hasta el momento, en que se comprobó que el material biológico seleccionado producía nódulos, único criterio fundamental para identificar el género Rhizobium(NORRIS, 1968a).

La metodología antes señalada, permitió el aislamiento de 18 cepas bacterianas, las cuales fueron identificadas con números del 1 al 18.

II. AUTENTICACION DEL MATERIAL BIOLOGICO AISLADO

Se utilizaron semillas pregerminadas de frijol, para lo cual previamente se lavaron con etanol al 95 por ciento por un minuto y se sumergieron en bicloruro de mercurio al 0,2 por ciento durante cuatro minutos, agitando constantemente Se eliminó el bicloruro y se lavaron con 10 cambios consecutivos de agua destilada estéril; finalmente se colocaron en cajas de Petri estériles de 100 x 15 mm a razón de 15 semillas por caja, se humedecieron con 5 ml/caja de agua destilada estéril y se dejaron en un sitio conveniente del laboratorio con buena iluminación y limpio para que germinaran. Cuando la radícula tenia unos cuatro cm de longitud, se trasplantaron a tubos de 200 x 25 mm, que contenían 35 ml del medio de cultivo Seedling-agar en cuña (recomendado por ROUGHLEY, 1970) a razón de una semilla por tubo.

La parte inferior del tubo, a partir de la cuña de medio, se cubrió con papel oscuro para proteger a las raíces de la luz. El material así preparado fue llevado a una cámara de iluminación de 3 x 2 x 2 m (Fig. 1 y 2), en la cual se registraron las siguientes temperaturas promedio: hora 6, 12, 18 y 24; 18° C, 25° C, 25° C, y 17° C respectivamente. Lo`; tubos permanecieron taponados con algodón hasta el momento en que las plantas alcanzaron la parte superior del tubo. Cuando las plantas tenían tres días de sembradas, se efectuó la inoculación. Para esta operación, cada una de las 18 cepas bacterianas objeto de la prueba, fue inoculada por duplicado, utilizándose una ansa metálica, bien cargada con el material biológico puro, el cual se depositó en la parte inferior de la cuña y se agregó un ml de agua destilada estéril, con el objeto de proporcionar una humedad favorable a las bacterias nodulantes. Se dejaron 10 plantas no inoculadas como testigo, para comprobar si la formación de nódulos era debida al material inoculado o a la contaminación ambiental. Esta prueba duro 45 días, durante los cuales, la unidad de aire acondicionado, contenida en la cámara (12.000 B.T.U) permaneció funcionando día y noche, mientras que la luz artificial se encendía a la hora 7 Y se apagaba a la hora 18. Las plantas fueron regadas periódicamente con agua destilada estéril.

Figs. 1 y 2. Vista externa e interna de la cámara de iluminación. Se puede apreciar la distribución en el techo (Gates, 1968) de tubos de luz ultravioleta (4), tubos fluorescentes (42 de 80 vatios cada uno) y bombillos incandescentes (8 de 15 vatios cada uno) y la ubicación de la unidad de aire acondicionado

RESUI.TADOS, DISCUSION Y DIFERENCIACION DE CEPAS DE LA ETAPA II

Aun cuando se tomaron todas las precauciones para evitar la contaminación ambiental, hubo cierto crecimiento microbiano, generalmente hongos, en la superficie de la cuña del medio de cultivo; sin embargo, en ningún caso se formaron nódulos en los testigos. Las cepas que resultaron positivas fueron las identificadas con los números 2, 5, 10, 15, 16 y 18. Los nódulos fueron visibles de los 10 a 12 días, después de efectuada la inoculación, presentaron forma redondeada y estaban situados cerca del cuello de la raíz (Fig. 3), al cortarlos se observó en la zona central una coloración rosada (Fig. 4), presumiblemente debido a la presencia del pigmento leghemoglobina (SMITH. 1949). Se tomaron fotomicrografías del interior de los nódulos desarrollados en los tubos correspondientes a la cepa 10 (Fig. 5, 6 y 7) y según éstas se pudo constatar que los organismos que allí se encontraban no presentaban la forma ramificada, semejando letras que señala GARASSINI, 1962 (Fig. 8). Las cepas que dieron un resultado positivo fueron estudiadas detenidamente y se pudo presumir que las identificadas con los números 2, 5 y 18 correspondían a un material biológico, y las numeradas 10, 15 y 16 a otro material, en otras palabras, se habían aislado 2 cepas diferentes, motivo por el cual el trabajo se continuó sólo con las cepas 5 y 10, las cuales fueron seleccionadas al azar.

Un aspecto característico de este ensayo, fue la no observación de diferencias notables entre las plantas que formaron nódulos y las que no los formaron (Fig. 9). Con este resultado, se podría pensar, que el material probado no fue efectivo en la fijación del nitrógeno atmosférico, o también que no se suministraron las condiciones apropiadas, para que las cepas de Rhizobium manifestaran su efectividad. Lo último se dice porque, según opinión del Dr. P. S. NUTMAN * el método utilizado en esta prueba, no permite la obtención de resultados favorables, cuando se trata de medir la efectividad nodular en plantas leguminosas de semillas grandes Quizás ello se debe a que el desarrollo del sistema radicular está restringido por el poco espacio disponible en los tubos utilizados.

DIFERENCIACION DE LAS CEPAS 5 Y 10

Crecimiento. La cepa 5 presentó un crecimiento comparativamente rápido y abundante a los tres días de sembrada. La cepa 10 presentó un crecimiento lento (10 días).

Forma de las colonias. En la cepa 5 las colonias tenían forma circular con elevación difusa. La cepa 10 presentó colonias circulares, pero marcadamente convexas.

* Dr. P. S. Nutman Rothamsted Experimental Station. Harpenden. England. Comunicaci6n personal.

Fig. 3. Raíces noduladas de frijol, desarrolladas por el método de los tubos

Fig. 4. Nódulos de plantas de frijol, desarrolladas en tubos. Derecha: nódulos enteros ¡ izquierda: nódulos cortados por la mitad

Figs. 5 y 6. Bacteroides de nódulos de frijol desarrollados en tubos. Fotomicrografías con microscopio electrónico, "Mini-Sem" Hitachi, Akashi Scaning Electron Microscope, Model MSM-2. x 7.650

Fig. 7. Vista aumentada de la Fig. 6 x 15.300

Fig. 8. Fotomicrografía con microscopio electrónico, de formas bacteroides típicas, correspondientes a Rhizobium. Tomada de Garassini (1962)

Fig. 9. Plantas de frijol, desarrolladas por el método de los tubos. Derecha: inoculada. Izquierda: testigo

Consistencia del material biológico. La cepa 5 presentó consistencia viscosa, adhiriéndose fácilmente al ansa. La cepa 10 presentó consistencia gomosa y difícil de asir con el ansa.

Desarrollo en Y.M.A. con bromotimol axul. La cepa 5 viró el color del medio de azul a amarillo, lo que indica producción de ácidos. La cepa 10 no alteró el color original del medio (azul) . En esta prueba se utilizaron tubos de ensayo de 150 x 16 mm preparados con cuñas de 8 ml del medio Y.M.A. al cual se le incorporó 5 ml/1 de una solución alcohólica al 0,5 por ciento del indicador bromotimol azul (VINCENT, 1970).

De acuerdo a las características primera y última, según lo establecido por NORRIS (1968 b), se podría considerar que la cepa 10 correspondió al "tipo cowpea" y la cepa 5 a organismos asociados con las tribus altamente especializadas Vicieae y Trifolieae.

III. VERIFICACION EN EL LABORATORIO DE LA EFECTIVIDAD DEL RHIZOBIUM AISLADO

Para la ejecución de esta etapa del trabajo se siguió el método modificado de la "botellajarra" de Leonard (VINCENT, 1970), que permite un, mejor desarrollo del sistema radicular, por cuanto se dispone de mayor espacio.

Se utilizaron botellas de vidrio transparente de un litro de capacidad, cayos fondos fueron eliminados mediante esmeril, lavándose luego muy bien con detergente . Las mechas fueron preparadas con hilo grueso de algodón (guaral). La arena se obtuvo en el sector Guamita del río Limón-Estado Aragua, se lavó muy bien con agua corriente para eliminar residuos de sierra, y se tamizó, tomándose la comprendida entre los tamices Nº 8 (2,38 mm) y N° 50 (0,297 mm) de la US Standard Sieve series Fischer Scientific Company, y se secó en hornos de aire caliente a 140 ° C. El material retenido en el tamiz N° 8 se consideró grave, se colocó en fundas metálicas para cajas de Petri y se esterilizó en horno a 140° C por 6 horas. Como solución nutritiva se utilizó la de NORRIS (NORRIS 1968a).

Fig. 10. Unidad "botella-jarra" conteniendo arena y solución nutritiva. Se puede observar la mecha y la cinta adhesiva que sella los dos recipientes

Montaje de una unidad "botella-jarra".: En la parte central de la botella, se colocó una mecha, la cual fue segurada con un tapón de lana de vidrio, colocado en la boca de la botella. Un Kg de arena se mezcló con un g de carbonato de calcio precipitado (CaCO3) y se agregó a la botella invertida, la cual a su vez fue depositada en un fresco o jarra de vidrio transparente y boca ancha, de un litro de capacidad (Fig. 10). Se midieron 800 ml de solución nutritiva y se agregó lentamente a través de la arena hasta que comenzó a drenar en el fresco; la solución restante se añadió directamente al fresco.

La unión de la botella con el fresco fue sellada con cinta de pegar (tirro). El fondo cortado de la botella fue cubierto con papel toalla triple y asegurado con bandas de goma. La unidad fue cubierta desde el nivel de la arena hasta el fondo del fresco con papel oscuro (Fig. 11) y se esterilizó en autoclave a 121° C y 15 libras de presión por 2 horas. Se montaron en total 28 unidades "botella-jarra" y cada una fue sembrada con 4 semillas pregerminadas de frijol, las cuales fueron preparadas y esterilizadas de manera similar a las utilizadas en la etapa II. Cuando las semillas tenían dos días de germinadas, se transplantaron a la "botella-jarra". Esta operación se efectuó en la cámara de iluminación. Se retiró el papel toalla y con una pinza metálica estéril, se hicieron hoyos en la arena, donde se colocaron luego las semillas germinadas. Finalmente, sobre cada botella se coloró la tape estéril de una caja de Petri; a los 4 días del transplante, se eliminó de cada unidad las dos plantas menos desarrolladas.

Fig. 11. Unidad "botella-jarra" lista para ser esterilizada en autoclave

TRATAMIENTOS APLICADOS EN EL ENSAYO

A) Cepa 5: Inoculación con la cepa 5.

B) Cepa 10: Inoculación con la cepa 10.

C) KNO₃: Sin inoculación, pero tratadas con 0,05 por ciento de KNO₃.

D) Testigo: Sin inoculación y sin KNO₃.

De cada tratamiento se hicieron 7 replicaciones, considerándose como unidad la botella-jarra, sin embargo, en los tratamientos cepa 5, KNO₃ y testigo, hubo que descartar una unidad debido a que las plantulas mostraron retraso en el desarrollo, ocasionado posiblemente por el trasplante. ~

INOCULACION

El material biológico correspondiente a las cepas 5 y 10, tenía, para el momento en que se utilizó en este ensayo, 10 meses de aislado y fue conservado a una temperatura de 10° C, mediante repiques cada dos meses, en Y.M.A. con rojo Congo. Previo a la inoculación los cultivos puros de las cepas 5 y 10, fueron suspendidos en 15 ml de caldo Extracto de levadura-Manitol con rojo Congo. De cada suspensión se sembró un ml en tubos que contenían 5 ml del mismo medio de cultivo, con el objeto de proporcionar posteriormente a cada planta, aproximadamente la misma cantidad del inóculo, correspondiente a los tratámientos cepa 5 y cepa 10. Los tubos sembrados fueron incubados a 27° C por 10 días. La inoculación se realizó cuando las plantas tenían 8 días de sembradas en la botella y la operación consistió en volcar el contenido de cada tubo sembrado, en la zona radicular de cada planta. Las plantas que no fueron inoculadas, recibieron la misma cantidad de medio de cultivo estéril.

Cuando las plantas alcanzaron el borde superior de las botellas, se removieron las tapes que cubrían cada unidad y en su defecto se coloco sobre la arena suficiente cantidad de grave estéril, hasta alcanzar una altura de unos 2 cm. Esto se hizo con la finalidad de disminuir los riesgos de contaminación ambiental, evitándose así el contacto directo de la arena impregnada de solución nutritiva con el ambiente. Cuando las plantas tenían 15 días de edad, fueron sacadas de la camara de iluminación y colocadas en un sitio apropiado del laboratorio, con buena iluminación natural y limpio. Esto se hizo porque en ensayos preliminares se notó que la iluminación de la cámara no era la más apropiada para el normal desarrollo de las plantas y también por el limitado espacio allí disponible, lo que impedía llevar el ensayo hasta su culminación, en el tiempo estipulado de 10 semanas. La iluminación de la cámara, promedio de 10 lecturas, fue de 1.300 bujías-pie, a la hora 8 :30 y la iluminación del sitio laboratorio donde se colocaron las unidades botella-jarra, promedio de 18 lecturas fue a la hora 8 :00, 11:20 y 17:30 de 2.630, 3.250 y 2.240 bujías-pie, respectivamente. Para estas mediciones se utilizó un fotómetro (Light Meter General Electric Type 213) con escala de 0 a 5.000 bujías-pie.

Las plantas fueron regadas periódicamente, cuando el nivel del líquido llegaba a la boca de la botella, se utilizó agua destilada estéril y la misma se agregaba directamente al fresco, retirándose previamente la cinta de tirro y sellándose nuevamente la unidad, al finalizar la operación.

El ordenamiento de las botellajarra, dentro de la cámara y en el laboratorio, se hizo por tratamiento, ello tuvo por finalidad evitar que las plantas testigo quedaran intercaladas con las plantas inoculadas, disminnyéndose así los riesgos de contaminación con Rhizobium, al momento de efectuar los riegos. La distribución en el espacio fue: cepa 5, cepa 10, KNO₃, testigo, con el objeto de formar cuatro bloques adyacentes.

La duración del presente ensayo fue de 10 semanas, iniciándose en el momento en que se pusieron a germinar las semillas (11-9-74) y finalizándose cuando las plantas tenían 69 días de sembradas (1811-74).

La efectividad de las cepas 5 y 10, en la fijación del nitrógeno atmosférico, fue valorado en base a las siguientes mediciones:

Crecimiento longitudinal del tallo (cm) . Se efectuaron 6 mediciones a intervalos de una semana; la primera se hizo cuando las plantas tenían 34 días de edad y la última cuando tenían 69 días. Se usaron como puntos de referencia: el nudo correspondiente a las primeras hojas verdaderas y el ápice del tallo principal. La medición sobre la planta se hizo con una cuerda de hilo grueso, con la cual se siguió lo más exactamente posible la trayectoria del tallo y luego se coloco la cuerda sobre una regla graduada.

Area foliar total (cm²). Esta medición se hizo al finalizar el ensayo. Se utilizó el método del papel heliográfico, el cual consiste en imprimir sobre el papel la superficie de las hojas y revelar luego con vapores de amoníaco. El área foliar se obtuvo en forma gravimétrica, es decir, se usó la relación que existe entre peso y área, para lo cual se pesaron previamente, varios cuadros de papel heliográfico de superficie conocida. Este método ha sido utilizado por MILTHORPE (1969), CABRERA (1972) Y es el que actualmente sigue la Cátedra de Fitofisiología de la Facultad de Agronomía de la Universidad Central de Venezuela. La medición se efectuó sobre todas las hojas de cada planta.

Peso seco de la parte área (g). Para esta medición se utilizó el material desarrollado a partir del primer nudo y fue secado en estufa a 60° C por 48 horas.

Peso seco de la parte radicular (g) . Debido a la dificultad que presentó la separación de las raíces de cada una de las dos plantas, contenidas en cada unidad botella-jarra, se decidió hacer las mediciones por botella. Se consideró como material radicular, la porción que quedó cuando se separó la parte aérea y el mismo fue secado en estufa a 60° C por 48 horas.

Consumo total de agua (ml) . Estas mediciones se hicieron por botella y el valor de las mismas se obtuvo por diferencia (consumo total de agua = agua total agregada-agua total sobrante).

Contenido de nitrógeno total en la parte aérea y en la parte radicular (mg). Las muestras utilizadas en estas determinaciones fueron previamente molidas. Se siguió el método de micro-Kjeldahl.

· Los análisis fueron realizados en el Instituto de Edafología, Facultad de Agronomía, Universidad Central de Venezuela.

Análisis estadístico. Se efectuaron análisis de varianza para: crecimiento longitudinal del tallo, área foliar total, peso seco de la parte aérea y de la parte radicular, consumo total de agua y nitrógeno total en la parte aérea y en la parte radicular. Las diferencias de los tratamientos cepa 10, cepa 5 y KNO3 respecto al testigo fueron detectadas por la prueba de "t" y las diferencias entre cepa 10, cepa 5 y KNO3 por la prueba de Duncan. En ambos caves se utilizó como niveles de significación 1 por ciento y 5 por ciento.

Mediciones colaterales. Se hicieron análisis de fósforo, potasio y calcio en las muestras utilizadas para el análisis de nitrógeno. Se efectuaron también análisis de correlaciones en las variables correspondientes a la parte aérea y en las correspondientes a la parte radicular, no incluyéndose en los mismos al testigo, debido a que en éste no se manifestó ningún tipo de asociación.

RESULTADOS Y DISCUSION DE LA ETAPA III

Los resultados obtenidos son presentados y discutidos en dos partes: la primera corresponde a las variables utilizadas para medir la efectividad de las cepas 5 y 10; y la segunda corresponde a las mediciones colaterales.

PRIMERA PARTE

1. Crecimiento longitudinal del tallo (cm)

Las mediciones de esta variable fueron realizadas, cuando las plantas tenían 34, 41, 48, 55, 62 y 69 días de sembradas. Para la última lectura no se incluyó el testigo, en el análisis de varianza efectuado, por cuanto manifestó, para ese momento, una marcada discontinuidad en el crecimiento.

A las primeras cinco mediciones se les hizo la prueba de homogeneidad de varianza de Bartlett, con la finalidad de efectuar un análisis en conjunto, pero el valor de ji-cuadrado = 97,76 fue altamente significativo, por lo que los análisis se efectuaron para cada una de las mediciones.

Análisis de varianza. Como puede observarse en los Cuadros 1,1; 1,2; 1,3; 1,4; 1,5 y 1,ó, los valores de F resultaron todos altamente significativos y correspondieron a 6,38; 9,54; 17,97; 24,33; 53,17 y 8,8 respectivamente.

CUADRO Nº1.1. CRECIMIENTO LONGITUDINAL DEL TALLO (cm) PLANTAS DE 34 DIAS

CUADRO Nº 1.2. CRECIMIENTO LONGITUDINAL DEL TALLO (cm) PLANTAS DE 41 DIAS

CUADRO Nº 1.3 . CRECIMIENTO LONGITUDINAL DEL TALLO (cm) PLANTAS DE 48 DIAS

CUADRO 1.4. CRECIMIENTO LONGITUDINAL DEL TALLO (cm) PLANTAS DE 55 DIAS

CUADRO N° 1.5. CRECIMIENTO LONGITUDINAL DEL TALLO (cm) PLANTAS DE 62 DIAS

CUADRO Nº 1.6. CRECIMIENTO LONGITUDINAL DEL TALLO (cm) PLANTAS DE 69 DIAS

En el Cuadro 1.7 se muestran los promedios del crecimiento longitudinal del tallo por tratamiento y por planta para las diferentes edades de las plantas y el mismo revela que el KNO₃ es el que acusa la mayor media en las cuatro primeras mediciones; el segundo lugar en promedios le correspondió a la cepa 10; el tercero a la cepa 5 y el cuarto al testigo; sin embargo, en las mediciones efectuadas a los 62 y 69 días el orden decreciente de promedios fue: cepa 10, cepa 5, KNO₃ y testigo.

En la primera medición sólo el KNO₃ mostró una diferencia altamente significativa, respecto al testigo. Las diferencias del KNO₃ con la cepa 5 y la cepa 10 fueron de 3,85 y 3,3 cm respectivamente, las cuales fueron significativas; mientras que la diferencia entre cepa 10 y cepa 5 de 0,55 cm no fue significativa.

CUADRO Nº 1.7. PROMEDIOS DE CRECIMIENTO LONGITUDINAL DEL TALLO (cm) POR TRATAMIENTO Y POR PLANTA

En la segunda medición se observaron diferencias altamente significativas del KNO₃, cepa 10 y cepa 5 respecto al testigo. Las diferencias del KNO₃ con la cepa 5 y la cepa 10, fueron 11,21 y 10,22 cm respectivamente, las cuales no fueron significativas. La diferencia entre cepas fue de 0,99 cm.

En la tercera, cuarta y quinta medición se mantuvo la tendencia de la segunda medición, es decir, los tratamientos KNO₃, cepa 10 y cepa 5 manifestaron diferencias altamente significativas respecto al testigo, sin embargo las diferencias entre sí de los tratamientos KNO₃, cepa 10 y cepa 5, no fueron significativas.

En la sexta medición como ya se dijo antes, no se incluyó el testigo en el análisis de varianza efectuado, siendo los resultados obtenidos los siguientes: hubo una diferencia altamente significativa entre la cepa 10 y el KNO₃; la diferencia entre las cepas 10 y 5 fue significativa, pero no lo fue la diferencia entre cepa 5 y KNO₃. Para esta misma medición y según el Cuadro 1.7, el testigo incrementa 3,29 cm con respecto a la medición anterior; sin embargo, de las observaciones realizadas durante el ensayo, se puede decir que el estado general de estas plantas era francamente decadente (Fig. 12), presentando la mitad de las mismas la parte terminal seca.

En el Gráfico 1 puede observarse, a partir de la segunda medición, diferencias notables de las cepas 5 y 10 respecto al testigo, las cuales tienden a ser mayores a medida que aumenta la edad de las plantas llegando un momento (quinta y sexta medición) en que dichas cepas .superan también al tratamiento KNO₃.

Se pudo observar también en el transcurso del ensayo, que las hojas inferiores en las cepas 5 y 10 fueron de menor tamaño que las del KNO3, pero no así las hojas superiores, las cuales estaban más desarrolladas y presentaban mejor color en las dos cepas (Figs. 13 y 14).

Fig. 12. Plantas de frijol desarrolladas por el método de la "botella-jarra". De izquierda a derecha:

inoculada con la cepa 5, testigo, inoculada con la cepa 10, tratada con KNO3

Gráfico 1. Crecimiento longitudinal del tallo. Cada valor es el promedio de 12 ó14 mediciones.

En el transcurso del ensayo no se observó en ningún momento que las plantas de las cepas 5 y 10 estuvieran por debajo de las plantas testigo, lo cual está en desacuerdo con lo establecido por SAVOSTIN (1950), quien sostiene que en las etapas iniciales de la inoculación las plantas manifiestan un retardo en su desarrollo. Las deficiencias de nitrógeno en l as plantas testigo empezaron a manifestarse a la cuarta semana (Fig. 15); mientras que en el tratamiento KNO3, la deficiencia comenzó a manifestarse en la octava semana.

2. Area foliar total (cm²)

En el Cuadro 2.1, correspondiente al análisis de varianza para área foliar total, la fuente de variación para tratamiento fue altamente significativa.

CUADRO N° 2.1. AREA FOLIAR TOTAL (Cm2)

Las diferencias de los tratamientos cepa 5, cepa 10 y KNO₃ respecto al testigo, fueron altamente significativas; lo cual puede observarse en el Cuadro 2.2.

CUADRO Nº 2.2. PROMEDIOS DE AREA FOLIAR TOTAL (Cm2) POR TRATAMIENTO Y POR PLANTA

Las diferencias de las cepas 5 y 10 con el KNO3 fueron de 330,1 y 412,8 cm2 respectivamente, las cuales fueron altamente significativas, no siendo significativas la diferencia entre cepas, la cual fue de 82,7 cm². Los resultados obtenidos con el área foliar pueden ser observados en el Gráfico 2.

Fig. 13. Hojas de frijol correspondientes al tercer nudo. Tomadas de plantas desarrolladas por el método de la "botella-jarra"

Fig. 14. Hojas de frijol correspondientes al octavo nudo. Tomadas de plantas desarrolladas por el método de la "botella-jarra"

Fig. 15. Plantas de frijol desarrolladas por el método de la "botella-jarra". De izquierda a derecha: inoculada con la cepa 10, testigo, inoculada con la cepa 5

3. Peso seco de la parte aérea (g)

El análisis de varianza de esta variable, según el Cuadro 3.l, dio un valor de F altamente significativo.

CUADRO Nº 3.1 PESO SECO PARTE AEREA (g)

En el Cuadro 3.2 puede apreciarse que los tratamientos cepa 5, cepa 10 y KNO₃ mostraron diferencias altamente significativas, respecto al testigo.

Gráfico 2. Area foliar total. Cada valor es el promedio de 12 014 mediciones.

CUADRO N, 3.2. PROMEDIOS DE PESO SECO DE LA PARTE AEREA (g) POR TRATAMIENTO Y POR PLANTA

Las cepas 10 y 5 comparadas con el KNO3, mostraron diferencias de 1,53 y 0,89 g, respectivamente las cuales fueron para el primer caso, altamente significativas y para el segundo caso significativas. La diferencia entre cepa 10 y cepa 5, de 0,64 g no fue significativa. En el Gráfico 3 están representados los valores correspondientes al Cuadro 3.2.

4. Peso seco de la parte radicular (g)

En el Cuadro 4.1, correspondiente al análisis de varianza de esta variable, puede apreciarse un valor de F altamente significativo.

CUADRO N 4.1. PESO SECO DE LA PARTE RADICULAR (g)

Los tratamientos cepa 5 y cepa 10 mostraron diferencias altamente significativas respecto al testigo; y la diferencia entre KNO₃ y testigo fue significativa; según puede observarse en el Cuadro 4.2, correspondiente a los promedios por tratamiento y por botella (raíces de dos plantas) del peso seco de la parte radicular.

CUADRO 4. 2. PROMEDIOS DEL PESO SECO DE LA PARTE RADICULAR (g) POR TRATAMIENTO Y POR BOTELLA (2 PLANTAS)

TRATAMIENTOS

Grafíco 3. Peso seco parte aérea. Cada valor es el promedio de 12 ó14 mediciones.

Entre la cepa 10 y el KNO₃ hubo una diferencia de 0,43 g, la cual fue significativa. Entre cepa 5 y KNO₃ la diferencia de 0,19 g no fue significativa, como tampoco lo fue la diferencia de 0,24 g habida entre las dos cepas. Los valores del Cuadro 4.2 están representados en el Gráfico 4.

5. Agua total consumida (ml)

El análisis de varianza efectuado para agua total consumida fue altamente significativo, (Cuadro 5.1).

CUADRO N, 5.1 AGUA TOTAL CONSUMIDA (ml)

En el Cuadro 5.2 se observe que los tratamientos cepa 10, cepa 5 y KNO₃, presentaron diferencias altamente significativas respecto al testigo. Entre cepa 10 y KNO₃ la diferencia fue de 1.300,3 ml, la cual fue altamente significativa; la diferencia entre cepa 10 y cepa 5 de 557,8 ml no fue significativa, pero sí lo fue la diferencia entre cepa 5 y KNO₃, con un valor de 742,5 ml,.

CUADRO Nº 5.2. PROMEDIOS DE AGUA TOTAL CONSUMIDA (ml) POR TRATAMIENTO Y POR BOTELLA (2 PLANTAS)

En el Cuadro 5.3 se observe que el testigo es el que consume mayor cantidad de agua por unidad de peso seco de la parte aérea, y por unidad de área foliar total.

TRATAMIENTOS

Gráfico 4. Peso seco radicular Cada valor es el promedio de 6 ó 7 mediciones.

CUADRO Nº5.3. AGUA TOTAL CONSUMIDA (A.T.C.) POR UNIDAD DE PESO SECO DE LA PARTE AEREA (P.S.P.A.), Y AGUA TOTAL CONSUMIDA POR UNIDAD DE AREA FOLIAR TOTAL (A.F T ) POR TRATAMIENTO Y POR BOTELLA (2 PLANTAS)

En el Gráfico 5 están representados los valores del Cuadro 5.2, y en el Gráfico 6 los valores del agua total consumida por unidad de peso seco de la parte aérea.

6. Contenido de nitrógeno en la parte aérea (mg)

El análisis de varianza de esta variable arrojó, según el Cuadro 6.1, un valor de F altamente significativo.

CUADRO Nº 6.1. NITROGENO TOTAL EN LA PARTE AEREA (mg)

Los tratamientos cepa 10 y cepa 5 mostraron diferencias altamente significativas con el testigo, mientras que entre el KNO₃ Y el testigo no hubo diferencia significativa. Lo dicho anteriormente se puede apreciar en el Cuadro 6.2.

Gráfico 5. Agua total consumida. Cada valor es el promedio de 6 ó 7 mediciones.

TRATAMIENTOS

Gráfico 6. Consumo de agua por unidad de materia ,seca de la parte aérea. Cada valor e. el promedio de 6 o 7 mediciones.

CUADRO N 6.2. PROMEDIOS DE NITROGENO TOTAL. EN LA PARTE AEREA (mg) POR TRATAMIENT,O Y POR PLANTA

Las diferencias de las cepas 10 y 5 con el KNO3, de 81,7 y 60,0 mg, respectivamente, fueron altamente significativas. La cepa 10 mostró respecto a la cepa 5 una diferencia de 21,7 mg, la cual fue significativa. En el Gráfico 7 están representados los promedios obtenidos por tratamiento y por planta del nitrógeno total en la parte aérea.

7. Contenido de nitrógeno total en la parte radicular (mg)

En el análisis de varianza, efectuado para nitrógeno total en la parte radicular, se obtuvo, según el Cuadro 7.1 un valor de F altamente significativo:

CUADRO N, 7.1. NITROGENO TOTAL EN LA PARTE RADICULAR (mg)

En el Cuadro 7. 2, correspondiente a los promedios de nitrógeno total en la parte radicular, se puede apreciar que los tratamientos cepa 10 y cepa 5 manifestaron diferencias altamente significativas respecto al testigo, mientras que la diferencia del KNO3 en relación al testigo » fue significativa.

CUADRO N° 7.2. PROMEDIOS DE NITROGENO TOTAL EN LA PARTE RADICULAR (mg) POR TRATAMIENTO Y POR BOTELLA (2 PLANTAS)

TRATAMIENTOS

Grafico 7. Nitrogeno total en la porte aereo. Cada valor es el promedio de 12 'o14 mediciones.

Las diferencias de las cepas 10 y 5 con el KNO3 fueron 37,4 y 29,5 mg de nitrógeno, las cuales fueron altamente significativas. Entre cepa 10 y cepa 5 hubo una diferencia de 7,9 mg que no fue significativa. En el Gráfico 8 están representados los promedios por tratamiento y por botella (2 plantas) del nitrógeno total en la parte radicular.

Los Cuadros 8, 9 y 10 resumen los resultados obtenidos en cuanto a peso seco, contenido de nitrógeno y nitrógeno fijado, respectivamente.

CUADRO Nº 8. PESO SECO TOTAL (P.S.T.), PESO SECO PARTE AEREA (P.S.P.A.) Y PESO SECO PARTE RADICULAR (P.S.P.R.) EN (g) PESO SECO PARTE AEREA (P.S.P.A) Y PESO SECO PARTE RADICULAR (P.S.P.R.) EN (%). RELACION PARTE AEREA/PARTE RADICULAR. POR TRATAMIENTO Y POR PLANTA

CUADRO N° 9. CONTENIDO DE NITROGENO EN mg Y EN % EN LA PARTE AEREA (P.A),PARTE RADICULAR (P.R.) Y PLANTA TOTAL (P.T.). POR TRATAMIENTO Y POR PLANTA

Gráfico 8. Nitrógeno total en lo raiz. Cada valor es el promedio de 6 o 7 mediciones.

CUADRO N° 10. NITROGENO TOTAL FIJADO POR LAS CEPAS 10 Y 5 EN LA PARTE AEREA (P.A.), PARTE RADICULAR (P.R.) Y PLANTA TOTAL (P.T.), EN mg Y EN % POR CEPA Y POR PLANTA

* Valores obtenidos por diferencias de las cepas con el testigo (Ver Cuadro 9).

DISCUSION GENERAL

Tomando en cuenta los resultados obtenidos y considerando al nitrógeno como punto central de discusión, se puede decir que las cepas 5 y 10 sí fueron efectivas en la fijación del nitrógeno atmosférico, puesto que, en todas las variables utilizadas, siempre se obtuvieron diferencias altamente significativas al compararlas con el testigo. Por otra parte, se pudo apreciar, según los resultados del contenido de nitrógeno en la parte aérea, que las cepas fueron diferentes en su efectividad, siendo mejor la cepa 10, es decir, la que no produjo ácidos en el medio cultivo, lo cual no concuerda con los resultados obtenidos por AVILA LOZANO (1971) ya que en su caso, las cepas productoras de ácidos, fueron significativamente superiores. Debido a que en ningún caso las plantas inoculadas presentaron síntomas de deficiencias de nitrógeno, se podría considerar que en el caso de la cepa 10 hay un exceso de nitrógeno, el cual no es utilizado por las plantas para aumentar su peso seco y su área foliar, debido a que en ambos caves no se detectaron diferencias significativas entre cepas. Ahora bien, dadas las condiciones del ensayo, el cual fue realizado en el laboratorio, estando, por tanto, sujeto a limitaciones de espacio y tiempo, las plantas no cumplieron su ciclo normal, es decir, fueron cosechadas antes de finalizar su desarrollo reproductivo, no pudiéndose conocer qué hubiera ocurrido con el nitrógeno excedente en lo que respecta a rendimientos del grano, que es la caracteristica más importante en el cultivo del frijol.

El nitrógeno fijado por planta total (Cuadro N° 10) fue, para la cepa 10, de 2,50 por ciento y para la cepa 5 de 2,34 por ciento, los cuales no están comprendidos en los rangos reportados por SCHIFMANN (1958), quien establece, para la alfalfa, valores de 2,7 por ciento - 3,7 por ciento cuando las plantas están efectivamente nodulares; sin embargo, en el caso nuestro hay que considerar dos aspectos importantes: primero el frijol no está dentro de las leguminosas que fijan mayor cantidad de nitrógeno atmosférico, mientras que la alfalfa y el trébol están reportados como las leguminosas más eficientes (ALEXANDER, 1961; NUTMAN, 1971; ERDMAN, 1959); por otra parte, las cepas tenían, para el momento del ensayo, 10 meses de haber sido aisladas y ese envejecimiento ha podido repercutir en su efectividad.

En el Cuadro N° 9 se puede observar, que el por ciento de nitrógeno por planta total es ligeramente mayor en el testigo que en el KNO₃; ello se debe a que la disminución de la relación entre el peso seco de la parte aérea y el peso seco de la parte radicular, es más marcada en el caso del testigo (Cuadro N° 8); en otras palabras, es mayor el por ciento de la parte radicular, lo que conlleva un aumento en el por ciento de nitrógeno, porque la raíz presenta porcentualmente un mayor contenido del elemento. Lo dicho anteriormente hace pensar que la deficiencia de nitrógeno afecta más el desarrollo de la parte aérea que el de la parte radicular.

Como no se observaron diferencias significativas entre el KNO3 y el testigo, en lo referente al contenido de nitrógeno, en la parte aérea y en la parte radicular, se puede asumir que para el momento en que finalizó el ensayo, las plantas del KNO₃ estaban tan deficientes en ese elemento como el testigo, es decir, que el nitrógeno agregado inicialmente no fue suficiente para que las plantas desarrollaran normalmente; esta deficiencia repercutió significativamente en el área foliar y es posible que a ello se deba el poco desarrollo observado en las hojas superiores de las plantas tratadas con KNO₃, según se aprecia en la Fig. 14, p. 26. E1 desarrollo de las legumbres también se vio afectado por esta deficiencia, pudiéndose observar en la Fig. 16 que los frutos correspondientes a las cepas 5 y 10 eran relativamente normales, mientras que el KNO₃ muestra un fruto más pequeño y con el extremo vano.

En el Cuadro N° 10 se puede apreciar que el nitrógeno fijado en la raíz es porcentualmente superior al fijado en la parte aérea, lo cual podría ser explicado por el hecho de que es en los nódulos donde tiene lugar la fijación y ellos están localizados en la raíz. Ahora bien, la cantidad total fijada: es superior en la parte area, por cuanto esta porción representa, según el Cuadro NQ 8, un 82 por ciento del peso total de la planta, mientras que la raíz representa sólo un 18 por ciento. Lo dicho anteriormente implica que para el momento en que finalizó el ensayo, de la cantidad total de nitrógeno fijado por planta alrededor de un 80 por ciento estaba en la parte aérea y un 20 por ciento en la raíz; ello indica que, para una mejor utilización del nitrógeno fijado en la planta, la parte aérea debería ser incorporada al suelo. En la Fig. 17 se puede ver el desarrollo alcanzado por los nódulos, en ambas cepas; y la Fig. 18 muestra que la nódulación se presentó también en la porción radicular que desarrolló en el fresco que contenía la solución nutritiva.

Fig. 16. Legumbres de frijol. Tomadas de plantas desarrolladas por el método de la " botella -jarra "

Fig. 17. Raíces noduladas de frijol, en la porción radicularvque desarrolló en el volumen de arena. Plantas desarrolladas por el método de la "botella-jarra"

Fig. 18. Nódulos presentes en la porción radicular que desarrolló en la solución nutritiva. Plantas desarrolladas por el método de la "botella-jarra"

Tomando en cuenta que las plantas testigo empezaron a manifestar síntomas de deficiencias de nitrógeno a las cuatro semanas de edad , 1o cual no ocurrió en las plantas inoculadas , se puede establecer que para ese momento ya se había iniciado la fijación del nitrógeno atmosférico, pero el proceso empezó a ser realmente eficiente cuando las plantas tenían 41 días de edad, ya que es a partir de ese momento cuando el crecimiento en las plantas inoculadas es significativamente superior a las del testigo.

Según el Cuadro N° 5.2, el testigo es el menos eficiente, en la utilización del agua, puesto que es el que presenta los valores más altos por unidad de materia seca de la parte aérea y por unidad de área foliar total, ello quizás se debe a que, ante la escasez de nitrógeno, la planta no puede seguir sintetizando material celular, por lo que el agua que consume la pierde por transpiración.

SEGUNDA PARTE

Mediciones colaterales

Los resultados obtenidos en las mediciones efectuadas para fósforo, potasio y calcio son presentados en los Cuadros 11, 12 y 13, respectivamente.

,

CUADRO N° 11 CONTENIDO DE FOSFORO EN mg Y EN % EN LA PARTE AEREA (P.A ), PARTE RADICULAR (P.R.) Y PLANTA TOTAL (P.T.). POR TRATAMIENTO Y POR PLANTA

CUADRO N° 12. CONTENIDO DE POTASIO EN mg Y EN % EN LA PARTE AEREA (P.A.), PARTE RADICULAR (P.R.) Y PLANTA TOTAL (P T ) POR TRATAMIENTO Y POR PLANTA

:

CUADRO N° 13. CONTENIDO DE CALCIO EN mg Y EN % EN LA PARTE AEREA(P.A.), PARTE RADICULAR (P.R.) Y PLANTA TOTAL(P.T.). POR TRATAMIENTO Y POR PLANTA

CUADRO 14 CONSUMO DE AGUA (C.A.), FOSTORO (C.P.>, POTASIO (C.K.), CALCIO (C.Ca) Y RELACIONES DE C.P., C.K., Y C.Ca POR 100 ml DE AGUA. POR TRATAMIENTO Y POR BOTELLA(2 PLANTAS)

En los Cuadros Nos. 11, 12 y 13, se observe que el contenido por planta total de los elementos fósforo, potasio y calcio, siguió el siguiente ordenamiento, de mayor a menor: cepa 10, cepa 5, KNO₃ y testigo, con la sola excepción del tratamiento KNO₃, que en cuanto al contenido de potasio presentó valores superiores a los de las cepas (Gráfico N° 9). El ordenamiento señalado está ligado al consumo de agua y al peso seco radicular, sin embargo, las plantas menos eficientes en la utilización de esos elementos fueron las del testigo, porque habiendo asimilado relativamente mayor cantidad de fósforo, potasio y calcio, como se aprecia en el Cuadro 14, no fueron las que presentaron el mejor rendimiento en materia seca. Ello quizás se debe a que al estar el nitrógeno deficiente, la planta, si bien continúa asimilando los elementos contenidos en el agua, nos los puede utilizar en la síntesis de material celular nuevo, por lo que se concentran en los tejidos ya formados. Es posible que esto sea la cause de que el testigo presente los valores más altos cuando los resultados se expresaron en porcentajes (Gráfico N° 10).

Por otra parte, el mayor contenido de potasio en las plantas del KNO₃ podría atribuirse al tratamiento mismo, es decir, a la cantidad extra de potasio suministrado en forma de nitrato.

Lo señalado anteriormente se presenta como posibles causes de los resultados obtenidos, ya que planteamientos definitivos necesitarían determinaciones frecuentes y más detalladas.

Gráfico 9 Contenido de Nitrogeno (N), Fósforo (P), Potasio (K), Calcio (Ca), en mg y peso seco total (P.S.T)en gramos por tratamiento y por planta.

Gráfico 10 . Contenido de Nitrógeno(N) Fósforo (P) Potasio(K)Calcio (Ca) en % y peso seco total(P.S.T) en gramos. Por tratamiento y por planta.

ANALISIS DE CORRELACIONES

Este análisis se efectuó sobre las variables de la parte aérea y sobre las variables de la parte radicular, correspondientes a los tratamientos cepa 10, cepa 5 y KNO3. El testigo no se incluyó, porque como se señaló anteriormente, no presentó ningún tipo de asociación.

En la parte aérea, se correlacionaron los valores del nitrógeno con el peso seco de la parte aérea, crecimiento longitudinal del tallo, área foliar total y contenido de fósforo, potasio y calcio, correspondientes a esa porción. El análisis se hizo en forma parcial, es decir, por tratamiento y en forma total, con los valores de los tres tratamientos.

En la parte radicular, se correlacionó el nitrógeno presente en la raíz, con el peso seco, consumo de agua y contenido de fósforo, potasio y calcio en dicha parte. En este caso la correlación se hizo sólo en forma total, debido al escaso número de datos disponibles.

En los Cuadros Nos. 15 y 16 se den los coeficientes de correlación parcial y total respectivamente, correspondientes a la parte aérea y en el Cuadro N° 17 se presentan los coeficientes de correlación total, de la parte radicular.

Los resultados obtenidos en los análisis de correlación parcial y total en la parte aérea, indica una alta asociación del nitrógeno con las variables utilizadas, con la única excepción de la asociación nitrógeno-potasio, la cual muestra divergencias en los análisis parciales, con respecto al total, es decir, no hubo consistencia en los resultados de esta asociación.

CUADRO N° 15. COEFICIENTES DE CORRELACIONES PARCIALES DE LOS TRATAMIENTOS CEPA 10, CEPA 5 Y KNO₃, RELATIVOS A LA PARTE AEREA

CUADRO N 16. COEFICIENTES DE CORRELACION TOTAL DE LA PARTE AEREA

CUADRO N° 17. COEFICIENTES DE CORRELACION TOTAL CORRESPONDIENTES A LA PARTE RADICULAR

En lo referente a la parte radicular, se detectó una asociación positiva nitrógeno-peso seco; nitrógeno-consumo de agua y una asociación negativa nitrógeno-potasio, no existiendo asociación del nitrógeno con el calcio y el fósforo.

Aunque el número de observaciones en la parte aérea fue mayor que en la radicular, los resultados aquí exhibidos deben ser tomados con la debida precaución, por cuanto las condiciones del ensayo no permitieron disponer de suficientes observaciones. Debido a lo anteriormente expuesto, no fue posible hacer estudios confiables de regresión; sin embargo, sería interesante poder manejar una mayor cantidad de datos, que permitan fijar las curves de regresión múltiple, y ver si es posible, medir la fijación del nitrógeno atmosférico a través de otras variables de más fácil manejo, que las determinaciones de nitrógeno; ellas podrían ser el peso seco y el área foliar.

Tomando en cuenta las dificultades que presentó la separación de raíces, y considerando, que en la parte radicular no se presentaron, según el análisis de correlaciones efectuado, las mejores asociaciones, los estudios futuros se podrían limitar a la parte aérea.

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

Usando como punto de referencia los resultados obtenidos en este trabajo, se puede concluir:

1. La metodología de los tubos, puede ser utilizada para autenticar cepas de Rhizobium, pero no así para medir la efectividad del material biológico cuando se trabaja con plantas de frijol.

2. El Rhizobium nativo, correspondiente a frijol, varía en su efectividad y en este caso, resultó mejor el material biológico que no produjo ácidos en el medio Y.M.A. con bromotimol azul.

3. Hubo porcentualmente mayor fijación de nitrógeno atmosférico en la raíz que en la parte aérea; sin embargo, la cantidad total fijada es superior en esta última porción, por cuanto constituye un 82 por ciento de la planta total.

4. Debido a que el KNO₃ agregado inicialmente, no fue suficiente para permitir un desarrollo óptimo de las plantas de este tratamiento, no fue posible conocer, si la cantidad de nitrógeno atmosférico fijado por las cepas, fue suficiente para una producción máxima de materia seca. Por lo expuesto anteriormente, sería recomendable repetir la tercera etapa del trabajo, pero haciendo agregados periódicos de KNO₃ a fin de que las plantas de este tratamiento no sufran por deficiencias de nitrógeno y poder utilizarlas como patrón de comparación, una vez que se conozcan los requerimientos que por nitrógeno tiene el frijol.

5. Las condiciones bajo las cuales se ejecutó la tercera etapa, permitieron verificar la efectividad de las cepas en base a materia seca producida, sin embargo, sería interesante conocer la influencia del Rhizobium en la producción de grano seco, por ser el frijol fundamentalmente una leguminosa comestible. Para ello sería recomendable realizar un ensayo de campo, utilizando suelos pobres en nitrógeno, lo que, por otra parte, permitiría probar en una situación natural, la asociación Rihizobium leguminosa.

AGRADECIMIENTO

E1 autor expresa su agradecimiento a todas aquellas personas que hicieron posible la culminación de este trabajo; en especial a la profesora Margarita Cobo por su asesoramiento en los aspectos estadísticos; al bachiller Luis M. Ecarri por su colaboración en el montaje de los ensayos; al profesor Ganímedes Cabrera por la revisión del manuscrito y a los profesores Eduardo González G. y José de la

T. Hernández por el estímulo brindado en los momentos difíciles. Igualmente se agradece a los señores Salvador Urbina y Shusuke Okada la colaboración prestada en la obtención del material fotográfico.

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