Rev.
Fac. Agron. (Maracay)
27:95-103.2001.
Estandarización
de la metodología para caracterizar genotipos de algodón (Gossypium sp.)
mediante patrones electroforéticos de proteínas
- Lourdes González P.*
- Margaret Gutiérrez M.**
- Morela Fuchs**
ABSTRACT
Crop
characterization and evaluation are carried out by means of descriptive
(morphological and agronomic) classic techniques; at present,
biochemical and molecular techniques enable a quick and massive
evaluation of the populations. The biochemical characterization comprizes of
isozyme and protein electrophoresis. Protein electrophoresis is simpler than
isozyme studies; protein bands, contrary to the isozymes, could not be
influenced by the artifices used in the extraction procedures and by the
physiological state of the vegetable material. The purpose of the present
research was the obtention of a protocol for the study of protein
electrophoretic patterns, so that Gossypium sp. genotypes could be
characterized. Three commercial varieties (Stoneville, Delta Pine - 16 and
Acala Royal) were used for the methodology standardization. For the
electrophoretic analysis, scarified and non-scarified soaked seeds,
pre-germinated seeds and cotyledonous leaves were used. Also, five buffer
solutions were tested in three dilutions 1:1, 1:1.5 and 1:2 (fresh
weight/volume of buffer); discontinuous polyacrylamide gels in different
concentrations and two electric conditions were also assayed. The present
investigation demonstrated that by using scarified cotton seeds,
soaked in water for 24 h, and the B1 stamp pad for extraction, in a
system Disc-PAGE 5 - 15%, an appropriate first-quality extract was obtained
for the characterization of cotton genotypes.
Key
words:
Cotton, characterization, standardization, Gossypium, proteins
COMPENDIO
La caracterización y evaluación de los cultivos se realiza mediante técnicas
clásicas descriptivas (morfológicas y agronómicas); actualmente existen técnicas
bioquímicas y moleculares que permiten una evaluación rápida y masiva. La
caracterización bioquímica comprende la electroforesis de isoenzimas y de
proteínas. La electroforesis de proteínas es más sencilla que los estudios
isoenzimáticos; las bandas proteicas, a diferencia de las isoenzimáticas,
podrían no estar influidas por los artificios utilizados en los
procedimientos de extracción y por el estado fisiológico del material
vegetal. Se realizó la presente investigación
con
la finalidad de obtener un protocolo para el estudio de patrones electoforéticos
de proteínas a fin de caracterizar genotipos de Gossypium sp.
En la estandarización de la metodología se usaron tres variedades
comerciales (Stoneville, Delta Pine-16 y Acala Royal) y para las corridas
electroforéticas se probaron: semillas embebidas escarificadas y sin
escarificar, semillas pregerminadas y hojas cotiledonales; cinco soluciones
tamponadoras de extracción en tres diluciones 1:1, 1:1.5 y 1:2 (peso tejido/
volumen de solución tampón); geles de poliacrilamida en diferentes
concentraciones discontinuos, dos condiciones de corrida. La presente
investigación demostró que utilizando semillas de algodón escarificadas
y embebidas por 24 horas y
el tampón de extracción B1, en un sistema Disc-PAGE 5-15%, se logró obtener
un extracto adecuado y de buena calidad para caracterizar genotipos de algodón.
Palabras
clave: algodón, caracterización, estandarización, Gossypium, proteínas
Introduccion
Para
la mayoría de las plantas domesticadas y silvestres se han publicado trabajos
relevantes usando la técnica de proteínas e isoenzimas pero poco se ha señalado
para el género Gossypium, no obstante, en el cultivo del algodón, esta
técnica ha sido empleada para determinar proteínas
en semillas a fin de realizar estudios de aspectos de evolución (Cherry et al., 1970), para
identificar cultivares en bancos de germoplasma
(Zhang et al., 1998) y en la determinación de la variación genética en especies
de G. arboreum, ésto
permitió establecer que la India es el centro primario de diversidad de
esta especie (Wang et al., 1996).
La
electroforesis de proteínas tiene la ventaja de ser más sencilla que los
estudios isoenzimáticos, ya que éstos
están caracterizados por el uso de varios tampones y numerosos protocolos de
visualización enzimática. Sin embargo, aunque algunos genes de proteínas
particulares han sido mapeados, la información sobre la variabilidad
genética es más restringida y su potencial como marcador genético es
menor que en las isoenzimas para
medir la diversidad genética, estructura de poblaciones, etc. La técnica ha
sido utilizada para la identificación de cultivares en los cuales las proteínas
son fácilmente extraídas. En trigo por ejemplo, la técnica se ha utilizado
para conocer la calidad de harinas, en la cual ciertas subunidades de proteínas
están correlacionadas con calidad (Simpson y Withers,1986).
La presente
investigación se realizó con el objetivo de seleccionar el tejido, tampón de
extracción y condiciones de corridas óptimas para caracterizar genotipos de
algodón mediante patrones electroforéticos
de proteínas.
Materiales
y metodos
Se utilizaron tres
variedades comerciales (Stoneville, Delta Pine 16 y Acala Royal) procedentes del
Banco de Germoplasma de Algodón del CENIAP-FONAIAP en Venezuela. Para la
extracción de proteínas se utilizaron: semillas embebidas escarificadas
manualmente, semillas pregerminadas
y hojas cotiledonales de plántulas
de 7 días de edad. La imbibición se realizó
colocando las semillas en agua por 24 horas, posteriormente se procedió
a pesar las semillas sin escarificar y escarificadas. Para obtener las semillas
pregerminadas se colocaron diez semillas por cada variedad en cápsulas de petri
con papel absorbente humedecido con agua destilada, transcurridos cuatro días
se colectaron las plántulas individualmente.
Las
hojas cotiledonales se tomaron de plántulas de siete días de edad
individualmente, las mismas se obtuvieron sembrando
tres semillas por pote de cada variedad en una mezcla 1:1 de arena,
tierra, broza de coco.
Las
muestras se prepararon utilizando tres relaciones tejido: tampón (1:1, 1:1.5 y
1:2). Se usaron cinco soluciones tampón de extracción (Cuadro 1).
Cuadro
1. Soluciones tampón de extracción de
proteínas en tejidos de algodón
|
Componentes
de la solución
|
Referencia
|
Código
|
|
KCl
0.1 M, cisteína 20 mM, pH
7.3
|
Bourdon,
1986
|
B1
|
|
Ascorbato
0.47 M, sacarosa 2 M, seroalbúmina (BSA
) 10 mg/l, pH 7.4
|
Kloth,
1992
|
B2
|
|
Fosfato
de sodio 0.005 M, sacarosa 5%, b - mercaptoetanol 0.05%,
pH 7.0
|
Suiter,
1988
|
B3
|
|
Buffer
tris borato: Tris base 0.76 g, ácido
bórico 0.06 g (enrasar 50 ml),
pH 8.9
|
Stegeman
et al., 1985
|
B4
|
|
Agua
|
|
B5
|
El
extracto se obtuvo luego de macerar la muestra en un mortero preenfriado y
transferido a tubos de microcentrífuga de 1 ml, se clarificó centrifugando
durante diez minutos a 10000 g y 4ºC, posteriormente se modificó la
temperatura a 10ºC, ya que la anterior ocasionaba congelación de las muestras.
Una vez obtenido el extracto se procedió a cargar las muestras tomando 200 µl
del extracto, agregando 50 µl de sacarosa al 60% y 5 µl de amido black
agitando hasta homogeneizar la muestra. Para las corridas se tomaron 5 a 10 µl
de la muestra cargada.
Se usaron geles de
poliacrilamida, en un
sistema Disc-PAGE preparados de acuerdo al sistema de Laemmli (1970)
y diferentes concentraciones de poliacrilamida (4 - 10%, 5 - 15%,
6 - 12% y 6 - 15%).
Se utilizó una cámara
de electroforesis vertical, (10x8 cm) y las siguientes condiciones de corrida:
1) voltaje inicial 50 v el cual, se incrementó después
de 15 - 20 min a 100 v, amperaje y tiempo de corrida variable; 2)
amperaje fijo a 30 mA y voltaje libre, el cual al transcurrir el tiempo de
corrida se estabilizó en 100 v. El tiempo de corrida osciló entre tres y
cuatro horas. Se probaron dos tampones del
electrodo: Tris borato pH 6.5 y
Tris-glicina pH 8.3).
La
visualización para proteínas se realizó utilizando Azul de Coomassie como
indicador, según PHOMA-PHOR (Stegeman et al., 1985).
Se
realizaron corridas electroforéticas con la finalidad de seleccionar el tipo de
tejido, solución tampón de extracción y las condiciones de corridas, para
obtener un patrón de bandeo de buena calidad
que permitiera la caracterización de genotipos de algodón.
Los parámetros evaluados fueron la resolución y el polimorfismo.
Resultados
y Discusion
El
material vegetal seleccionado para preparar los extractos fue
semilla escarificada y embebida por 24 h, ya que con éstas se logró
mayor resolución y polimorfismo
que con el resto de tejidos evaluados.
Blogg
e Imprie (1982), señalan que las semillas secas o germinadas
son metabólicamente más estables que otros tejidos usados para realizar
electroforesis de proteínas e isoenzimas, y que cualquiera que sea el tejido
seleccionado como fuente para preparar extractos, debe garantizar que las
muestras se encuentren en el mismo estado fisiológico y ontogenético, ya que
está ampliamente demostrado que ocurren cambios cualitativos y cuantitativos en
proteínas y enzimas con la edad del cultivo.
Las
concentraciones de poliacrilamida de 4 - 10% y 6 - 12%, se descartaron porque
las bandas no se movilizaron, apilándose en el gel superior, lo que no permitió
una buena resolución. Las concentraciones de 5 - 15% y 6 - 15% dieron
resultados similares entre sí, obteniéndose una buena resolución de bandas.
En
el zimograma de proteínas en
Disc-PAGE 5 - 15% (Figura 1), los carriles 1, 2, 6, 7 y 8 corresponden a
extractos provenientes de semillas escarificadas y embebidas por 24 h; los
carriles 3 y 4 a extractos de semillas pregerminadas, los cuales mostraron menor
polimorfismo; y 5 y 10 a hojas cotiledonales en donde no se observó tinción de
proteínas. Para todas las variedades, hubo una mejor extracción de proteínas
en semillas embebidas por 24 horas.
El
principal objetivo de la extracción es efectuar un adecuado rompimiento de la célula
en un mínimo de tiempo para no calentar el extracto. El tampón de extracción
a utilizar depende de las características particulares de cada tejido, al igual
que la relación tampón: tejido, la cual es variable y debe optimizarse ya que
puede afectar la actividad enzimática (Weenden y Wendel, 1989).
La
solución tampón de extracción que permitió obtener un extracto de buena
calidad (alta resolución y nitidez de las bandas) para realizar las
diferentes corridas electroforéticas fue el tampón B1, con la relación tampón
de extracción: tejido 1:1.
Figura
1. Zimotipos de proteínas en
sistema Disc-PAGE 5 - 15%. De
izquierda a derecha, carriles 1, 2, 6, 7 y 8 corresponden a semillas embebidas
por 24 h; los carriles 3 y 4 a extractos de semillas pregerminadas; 5 y 10 a
hojas cotiledonales preparados con tampón B1
En
los zimotipos de proteínas en Disc-PAGE 5 - 15% (Figura 2), los carriles 1, 2 y
9 señalan los extractos realizados con el tampón B1. Los carrilles 3, 5 y 7
presentan el patrón de bandeo del extracto donde se utilizó el tampón de
extracción B2, este extracto no permitió una buena separación de bandas, ya
que se formó al final del carril una banda gruesa y marcada de seroalbúmina
bovina. Para la extracción de las
muestras de los carriles 4, 6 y 8
se usó el tampón de
extracción B3 (fosfato de sodio, sacarosa y mercaptoetanol) el cual se descartó
por no permitir visualización de proteínas, observándose bandas muy tenues,
lo que permitió inferir que este tampón de extracción no era adecuado para
extraer proteínas en tejidos de algodón.
El
tampón de corrida seleccionado fue
Tris-glicina, ya que con dicha solución se logró un mejor control del amperaje
y el voltaje y por ende mejores patrones de bandeo en todas las variedades
evaluadas. El ajuste de estas condiciones permitieron disminuir el efecto de la
electricidad sobre las corridas ya que otras combinaciones produjeron bandas
distorsionadas.
En
el Cuadro 2 se presenta un resumen de la metodología o protocolo seleccionado
para evaluar genotipos de algodón mediante patrones electroforéticos de proteínas
y en el zimograma de proteínas en Disc-PAGE 5 - 15% (Figura 3), se señalan
muestras procedentes de la combinación tampón de extracción B1 y semillas
escarificadas embebidas por 24 h,
donde se observó polimorfismo y resolución adecuada de bandas en todas las
muestras analizadas.
Figura 2.
Zimotipos de proteínas en semillas embebidas por 24 horas
separadas en sistema Disc-PAGE 5 - 15%. De izquierda a derecha: carriles
1, 2 y 9 extractos preparados con tampón B1, carriles 3, 5 y 7 extremos
preparados con tampón B2 y carriles 4, 6 y 8 extractos preparados con tampón
B3, para las variedades Stonville, Delta Pine 16 y Acala Royal en el mismo
orden, respectivamente
Estos
resultados muestran que la metodología seleccionada permite la separación de
bandas de proteínas en genotipos de algodón, lo que constituye una herramienta
que puede ser utilizada en posteriores trabajos de caracterización genética.
Cuadro 2.
Protocolo seleccionado para evaluar genotipos de algodón mediante patrones
electroforéticos de proteínas
|
Tejido
|
Tampón
de extracción
|
Condiciones
de corrida
|
Tampón
de corrida
|
Concentración
de poliacrilamida
|
|
Semillas
es-carificadas y embebidas 24 h
|
B1
(KCl 0.1 M y cisteína 20
mM) pH 7.3
|
Amperaje
fijo a 30
mA y voltaje libre
|
Tris-glicina
pH 8.3
|
Sistemas
Disc-PAGE 5 - 15%
|
Figura 3.
Zimotipos
de proteínas en sistema Disc-PAGE 5 - 15%. De izquierda a derecha extractos
preparados con tampón B1 y semillas escarificadas embebidas por 24 h. Carriles
2 y 3 Acala Royal, carril 4 Stonville, carriles 5 y 7 Deltapine. El resto de los
carriles corresponde a materiales nativos
REFERENCIAS
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